GFP转基因小鼠脊髓源NSCs移植于小鼠脊髓损伤模型后的成活分化情况

发布时间：2020-07-08 08:01

【摘要】：目的:(1)通过无血清培养技术从GFP+-小鼠胚胎脊髓分离和培养神经干细胞(NSC),采用免疫荧光技术鉴定NSC。(2)建立小鼠脊髓损伤模型,向脊髓损伤处附近注射GFP+-神经干细胞,观察小鼠运动恢复情况和GFP+-神经干细胞在体内的成活、分化情况,揭示神经干细胞在临床中治疗脊髓损伤的作用。方法:(1)GFP转基因小鼠的繁殖;(2)通过从GFP转基因小鼠的胎鼠体内获得脊髓源神经干细胞,体外分离培养并鉴定;(3)将小鼠随机分为空白组(30只),损伤组(30只)与细胞移植组(30只),采用Impactor M-III脊髓撞击器,对小鼠暴露的脊髓进行击打建立小鼠脊髓损伤模型。细胞移植组在击打后向损伤处注入5μL神经干细胞悬液;损伤组仅仅只击打脊髓;空白组不做任何处理;(4)在1 w、2 w、4 w、6 w和8 w不同时间节点进行行为学观察,记录小鼠的BBB运动功能评分和斜板实验结果;同时也在1 w、2 w、4 w、6 w和8 w时,每组分别处死6只小鼠,3只用于免疫组织化学检测和尼氏(Nissl)染色,另3只通过荧光定量PCR技术检测Nestin、ChAT和GFAP基因表达量的变化情况,观察NSC在小鼠脊髓损伤模型内的成活、分化状态及损伤脊髓的修复情况。结果:体外成功培养出了神经干细胞,将传至第三代的神经干细胞接种到载玻片,荧光显微镜下观察到细胞呈规则的圆形,折光性强,界限清晰,神经球发出很强的绿色荧光。免疫荧光法检测,Nestin表达呈阳性。采用Impactor M-III脊髓撞击器,对小鼠暴露的脊髓进行击打建立小鼠脊髓损伤模型。击打后小鼠双后肢均瘫痪,BBB评分为0,移植2 w后移植组较损伤组BBB评分有显著差异(P0.05),4 w移植组较损伤组斜板倾斜角度有明显差异(P0.05)。荧光显示移植的NSCs会在体内存活并迁移,部分保持未分化状态,少部分分化为胶质细胞,向神经元分化较少。PCR结果与免疫组织化学染色结果一致,Nestin显示在注射初期,移植组的Nestin的表达量明显高于损伤组,2 w后差距开始减少,并在6 w后与空白组表达接近;移植组与损伤组的ChAT的表达在损伤初期均减少,2 w时开始增多,移植组的增长明显高于损伤组;两组GFAP的表达在损伤后表达持续升高,但移植组GFAP的表达低于损伤组。Nissl染色结果显示损伤1 w~2 w时,移植组与损伤组的尼氏小体数量均持续减少;但4 w后开始出现新的尼氏小体,而且移植组的尼氏小体数量比损伤组的数量多。结论:(1)体外移植的神经干细胞可以在体内存活、分化。(2)NSCs对脊髓损伤的恢复有促进作用,这种作用是通过移植细胞后形成一个有利于恢复的微环境,增加向神经元分化的比例来促进恢复。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.2;R-332

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本文编号：2746305