lncRNA0177及lncRNA1670在DNA损伤应答中作用的初步研究

发布时间：2020-07-13 23:01

【摘要】：DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)不仅是细胞维持基因组稳定性的基石,DNA损伤应答缺陷更与多种疾病的发生发展相关。而长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作为目前研究的热点,现在已有众多研究表明长链非编码RNA在DNA损伤应答的多个环节中发挥了重要的作用。且长链非编码RNA的失调与缺陷的DNA损伤应答都与多种疾病的发生发展相关,因此挖掘更多参与DNA损伤应答的长链非编码RNA并深入揭示其在DNA损伤应答中的功能和其参与DNA损伤应答的分子机理,不仅能深化和丰富DNA损伤应答的理论知识,而且能极大加深我们对与之相关疾病发病机理的理解,更能在理论上指导临床治疗和药物研发。课题组前期通过高通量DNA芯片技术筛选出了多个可能参与DNA损伤应答的长链非编码RNA,本文研究其中的lncRNA0177和lncRNA1670,对它们在DNA损伤应答中的功能做了初步研究。本文主要得到以下结论:(1)使用CPC、CPAT以及RNAfold等生物信息学工具对两条RNA的编码能力及二级结构进行了预测和分析,得出它们均不具有蛋白质编码能力,且均可能与DNA、蛋白质等大分子发生相互作用;(2)核质分布实验表明lncRNA0177主要分布在细胞的细胞核中;(3)人体细胞在紫外光造成DNA损伤后,lncRNA0177的转录下调。而在应答甲基磺酸甲酯(MMS)、阿霉素(DOX)和博来霉素(Bleomycin)造成的DNA损伤时,lncRNA0177的转录显著上调。其中在受到MMS造成的损伤后4 h转录上调到最大值,而在受到阿霉素和博来霉素造成的损伤后12 h转录达到峰值;(4)为了进一步研究lncRNA0177是否参与了DNA损伤应答,本文利用RNA干扰(RNAi)的原理构建了lncRNA0177敲降单克隆细胞株和仅含敲降载体的对照细胞株。数据表明,在受到紫外光辐射引起的DNA损伤后,敲降lncRNA0177对细胞的生存率影响不显著,但在受到MMS和阿霉素引起的DNA损伤后,敲降lncRNA0177后细胞的生存率显著下降;(5)lncRNA1670在细胞受到紫外光造成的DNA损伤后转录显著上调,并在受到DNA损伤刺激后8 h达到最大值。在应答MMS造成的DNA损伤时,lncRNA1670的转录也显著上调,但在受到损伤后4 h转录上调达到最大值;(6)为了进一步研究lncRNA1670在DNA损伤应答中的作用,采取同样的实验手段,构建了lncRNA1670敲降单克隆细胞株和对照细胞株。实验表明敲降lncRNA1670会影响人体细胞经紫外光辐射和MMS处理后的生存率但不影响人体细胞经阿霉素处理后的生存率。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R346
【图文】：

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（6）核质 RNA 提取方法同 2.2.3.3 及 2.2.3.4。2.2.3.11 pSilencer2.1-U6 puro 载体本实验所用的 Neative 载体为 pSilencer2.1-U6 puro 载体，具体信息见表及如图 2.1。表 2.3 pSilencer 2.1-U6 Puro 干扰载体信息载体名称: pSilencer 2.1-U6 Puro干扰载体类型 RNAi 载体启动子 U6、SVP40载体大小 4455bp限制性内切酶 Hind Ш 和 BamH 筛选标记氨苄青霉素和嘌呤霉素

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正是这些按照一定规律组分子结构[77]。RNA 的三级构成的，因此通过研究生物大分子空间结构的方传统的实验方法所检测的大。所以借助于计算机通外公认的主要方法。它具假结的能力及其精确度指：（1）比较序列分析方法；（5）其它相关算法[79]。NA 序列的基础上，假定，配对的碱基使自由能降目前只已知了 lncRNA01A0177 的二级结构进行了

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硕士学位论文上图预测结果可以看出 lncRNA0177 具有与大分子相互作用的二级结构元环结构，表明 lncRNA0177 可能与蛋白质、DNA 或 RNA 发生相互作用而能。RNA 质量检测otal RNA 在提取之后要对其质量和浓度进行检测，质量合格的 RNA 才能用下一步实验。rRNA 是生物体内含量最多的 RNA，其中真核生物体内 rRNA8 S、18 S、5.8 S 和 5 S 四类，采用琼脂糖电泳法检测 RNA 质量时，质量NA 能清晰的看到三条条带，且最上面的 28 S 比中间的 18 S 亮两倍左右、光光度计测得的 OD260:OD280 在 1.8 到 2.0 之间。Total RNA 初提后可能因组 DNA 污染，从而影响后续的实验结果，因此要进行除基因组 DNA 的主要采用 DNaseI（Fermental）酶进行消化，去除基因组 DNA 的 RNA 也下一步纯化及质量检测。初提和除基因组 DNA 纯化后的 RNA 检测如图 2.4。

【参考文献】