铜绿假单胞菌重组Bb-OprI疫苗的构建及其免疫机制的初步研究

发布时间：2020-07-17 19:33

【摘要】：目的 构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)重组Bb-OprI疫苗,研究其免疫小鼠后诱导的保护力和免疫机制。方法 PCR扩增OprI抗原编码基因并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprI。将pGEX-OprI电穿孔转化大肠埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达产物。将重组质粒电穿孔转化两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifdum,Bb),SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达产物。将重组Bb-OprI疫苗灌胃接种小鼠,以PA01株进行攻击。分离肺脏和脾脏,检测肺组织的细菌负荷,ELISA检测血清抗体,MTT法检测脾细胞增殖,流式细胞术验证该疫苗对脾T淋巴细胞亚群分化和脾细胞凋亡的影响,PCR分析脾细胞因子和Treg变化。结果 成功扩增出194 bp的OprI基因,双酶切和PCR鉴定证实OprI基因成功克隆入pGEX-1λT中,并且pGEX-OprI成功转化BL21(DE3),BL21(pGEX-OprI)可表达Mr约32kDa的GST-OprI蛋白,Pa感染的鼠血清可识别该蛋白。pGEX-OprI成功转化Bb,Bb-OprI疫苗可表达Mr约32 kDa的GST-OprI蛋白,该蛋白能被Pa感染的鼠血清识别。Bb-OprI疫苗接种及PA01株攻击BALB/c鼠后,Bb-OprI组肺部的细菌负荷降低,疫苗组的血清抗体IgG、IgG2b、IgG3和IgE水平升高,脾细胞增殖和CD4+T细胞比例增加,脾细胞凋亡减少,疫苗组小鼠脾细胞可扩增出 IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-17 和 Foxp3 基因,两对照组PCR扩增均阴性。结论 成功构建了重组Bb-OprI疫苗,重组Bb-OprI疫苗可诱导BALB/c小鼠产生体液免疫、细胞免疫和免疫调节作用,从而抵抗Pa的感染并维持免疫稳态。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

１．１．１邋ＯｐｒＩ抗原编码基因ＰＣＲ扩增产物鉴定逡逑．１．１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＯｐｒＩ邋ｇｅｎＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－４：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＯｐｒＩ邋ｇｅｎｅＸ－Ｏｐｒｌ的双酶切鉴定逡逑体为对照，具有Ａｍｐ抗性的重组菌酶切后产生约４邋９４７邋ｂｐ的ｐＧＥＸ－ＵＴ载．２）。逡逑

图１．１．２ｐＧＥＸ－ＯｐｒＩ的双酶切鉴定逡逑Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐＧｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐＧＥＸ－Ｏｐｒｌ的ＰＣＲ鉴定逡逑的重组菌中抽提出的质粒为模板进图１．１．３）。逡逑Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５逦６邋７逦８逡逑ｂｐ逡逑１０邋０００邋Ｗ逡逑２邋０００Ｋｆｌ逡逑１５０0Ｃ逡逑ｉ邋ｏｏｏＰ逡逑５０0ｌ逡逑

１０邋０００邋Ｆ逡逑５邋０００９４７逡逑２邋００0Ｂ逡逑ｉｏｏｏＥ逡逑２５０逦１９４逡逑图１．１．２ｐＧＥＸ－ＯｐｒＩ的双酶切鉴定逡逑．１．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐＧＥＸ－Ｏｐｒｌ逡逑２：邋Ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐＧＥＸ－Ｏｐｒｌ；邋３ＥＸ－Ｏｐｒｌ的ＰＣＲ鉴定逡逑抗性的重组菌中抽提出的质粒为模板进行ＰＣＲ，（图１．１．３）。逡逑Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５逦６邋７逦８逡逑

【参考文献】

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本文编号：2759843