兔骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的实验研究

发布时间：2020-07-17 22:04

【摘要】：目的1.分析兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮细胞并进行鉴定的实验过程、步骤及结果。2.研究诱导培养时间对所得血管内皮细胞NO分泌量的影响及意义。3.探讨以家兔替代大鼠作为骨髓间充质干细胞供体和自体移植受体的可行性。实验方法一、选取3~4月龄的健康清洁级新西兰大白兔进行静脉麻醉操作,麻醉完成后于右下肢股骨用骨髓穿刺针于穿刺点垂直骨面穿刺进入骨髓腔,抽吸骨髓3ml,立即注入离心管中,充分混合成骨髓悬液。离心5min,去除上层的脂肪及组织液,收集管底的细胞。二、将收获的细胞进行原代培养,将收获的细胞用PBS液重悬,加入Percoll分离液中,进行离心;吸取中间厚度约0.2cm的乳白色细胞层,洗涤后再用培养液重悬;细胞计数,调整细胞浓度后以接种于塑料培养皿中,置于培养箱中培养;定期换液,去除未贴壁细胞。三、原代培养完成后接种传代培养,待细胞汇合达80%时,弃培养夜,清洗3次,加入0.125%胰蛋白酶消化后,光镜下观察细胞形态变化,待细胞间隙扩大,细胞呈不规则时,终止消化;收集细胞悬液并离心,用含青-链霉素的培养液重悬细胞,再按1:2接种传代。四、定向诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞选择细胞性状较稳定,生长状态良好的第3代细胞弃去培养液并清洗,加入含青-链霉素、VEGF、b FGF的内皮细胞诱导培养液,定期换液。连续镜下观察细胞形态的变化。五、流式细胞术鉴定取诱导培养的第三代血管内皮细胞应用流式细胞仪检测CD31、v WF的表达。细胞消化离心后,用PBS重悬,调整细胞浓度后分别加入到3个流式管中并标记为123,分别在123管中加入pbs、CD31、v WF,定容后上机鉴定。六、NO分泌量检测取诱导培养第5d、第10d、第15d的上清液,按照Griess试剂说明书方法操作,应用EXCEL绘制标准曲线,将所测样品吸光度代入计算NO分泌量,以均数±标准差表示,并采用配对样本t检验比较两两之间结果,以P0.05为差异具有统计学意义。结果一、(1)原代细胞接种4h后可见细胞贴壁生长,48h后换液时可见细胞集落生长,细胞呈梭形、三角形,10-12d后见细胞簇集,呈网状、旋涡状排列。传代细胞接种后生长迅速,培养5-6d后,呈长梭形排列均匀。加入内皮细胞诱导培养液后48h后,镜下观察可见部分细胞变为短梭形;诱导10 d后,细胞集簇生长,呈鱼群样排列;诱导20d后,可见内皮样细胞呈铺路石状排列细胞长度增加,形态扁平(2)流式细胞仪检测结果示:诱导产生的血管内皮样细胞CD31阳性率97.3%±0.8%,v WF阳性率95.7%±1.1%。(3)检测诱导培养第5d、第10d和第15d后上清液中的NO分泌量,显示:第5d上清液中NO分泌量为(31.25±2.67)μmol/L,第10d上清液NO分泌量为(65.88±3.64)μmol/L,第15d上清液中的NO分泌量为(86.31±3.93)μmol/L。二、对诱导分化获得的血管内皮细胞NO分泌量采用配对样本t检验比较三组结果,t=26.574≥t(df)0.05,差异存在统计学意义(P0.05)。NO分泌量第5d第10d第15d。三、实验采用相同的VEGF+b FGF的诱导方案,成功获得兔血管内皮细胞,与课题组前期的大鼠实验研究得出一致的结果。结论1.兔骨髓间充质干细胞可在VEGF与b FGF联合诱导下分化为血管内皮细胞。2.在诱导分化过程中,血管内皮细胞活性在15d内随培养时间逐渐增加,从而使NO分泌量增加。3.家兔可以替代大鼠作为骨髓间充质干细胞供体和自体细胞移植的受体,可以通过诱导兔骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞为自体细胞移植提供种子细胞。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

细胞,细胞长度,集簇,鱼群

呈网状、旋涡状排列。传代细胞接种后生长迅速，培养 5-6d 后，呈长梭形排列均匀，见图1。加入内皮细胞诱导培养液后 48h 后，镜下观察可见部分细胞变为短梭形；诱导 10 d 后，细胞集簇生长，呈鱼群样排列，见图 2；诱导 20d 后，可见细胞呈 VECs 常见的铺路石状排列，细胞长度增加，形态扁平，形似水流，见图 3。3.2 第一代和第三代细胞生长曲线根据细胞计数法测得的数据，应用 EXCEl 作图，见图 4。P1 代和 P3 代细胞的生长曲线相似呈现典型的“S” 形。细胞接种后的 24h 内处于潜伏期，随后开始分裂增殖，细胞数目增多，第 2-5d 细胞增殖速度较快

诱导培养,细胞

诱导培养10d第3代细胞×40Figure2cellsofpassage3culturedfor10days

生长曲线,生长曲线,诱导培养,细胞

第P1代和第P3代的生长曲线

【参考文献】