基于单个T淋巴细胞的手工显微分离及TCR基因的克隆
发布时间：2020-07-20 11:06
【摘要】：目的:通过建立单个T细胞的分离和基因扩增技术,来获取识别特定抗原表位肽的单个T细胞的TCR基因,为特异性TCR的获取提供了一种新方法,为以后获取肿瘤特异性TCR基因并利用特异性TCR基因修饰T细胞进行过继性免疫治疗打下基础。方法:一、单个淋巴细胞的手工显微分离及单细胞水平的RT-PCR扩增利用自制的毛细玻璃管、橡胶管和滤嘴组装成一套完整的单细胞分离工具,通过该分离工具分离出单个T淋巴细胞,然后使用不同的试剂盒进行反转录和GAPDH基因扩增,通过对比确定出扩增效率高的反转录试剂盒,并通过扩增BCL2、STAT1和CD8a基因进一步验证其扩增效率,优化其相应扩增条件,为扩增单个T淋巴细胞的TCR基因奠定实验基础。二、单个T细胞TCRA基因扩增方法的建立通过自制的手工分离单细胞工具分离出单个经特定富集的CD8~+T细胞后,分别采用5’RACE法和多重PCR法扩增单个T细胞的TCRA基因。通过采用不同的扩增条件、不同的特异性引物和不同的PCR扩增酶进行5’RACE法扩增TCRA基因条件的摸索;通过常规PCR和分步PCR法进行多重PCR法扩增TCRA基因的条件摸索。三、TCR(α和β链)重组表达载体的构建将第二部分单细胞扩增获得的TCR基因核心序列(CDR3)分别与对应的上游V区和下游C区片段通过融合PCR的方法拼接出全长序列。然后根据插入的目的基因和载体序列设计合理的同源重组引物和含酶切位点引物进行TCRα和TCRβ基因的扩增,后与pIRES2-Oligo载体连接,构建出TCR的重组表达载体。结果:一、成功组装单细胞分离工具并建立了手工显微分离单个T淋巴细胞的方法;通过对单个T细胞丰度较高的GAPDH基因扩增,摸索出了稳定的单细胞反转录和扩增方法,并通过扩增单个T细胞的BCL2、STAT1和CD8a基因得到了进一步的验证,为扩增单个T细胞的TCR基因奠定了实验基础。二、5’RACE法扩增单个T细胞的TCRA基因效果不理想。后对多重PCR扩增单个T细胞TCRA基因的方法进行优化,成功扩增出2个CD8~+T细胞各自的TCRA基因:1号细胞的TCRVα16和TCRVα2/3、4号单细胞的TCRVα26和TCRVα1/5。三、通过融合PCR法成功扩增出TCRβ5、TCRα1/5和TCRα26的全长序列。利用同源重组和酶切的方法成功构建出pIRES2-TCRβ5-TCRα1/5和pIRES2-TCRβ5-TCRα26重组表达载体。结论:本实验成功建立了单个T淋巴细胞的手工显微分离和基因扩增方法,在此基础上通过对单细胞TCR基因的方法摸索,成功建立了分步多重PCR扩增单个T细胞TCR基因的方法。该技术的建立为快速获取TCR-T细胞免疫治疗所需的特异性TCR基因提供了新的方法与思路,为促进TCR-T过继性细胞免疫疗法的应用研究奠定了基础。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
也会有不同数量的核苷酸随机插入 V 区与 J 区、V 区与 D 区,D 区与 J 区，形成VN(DN)J 的重排，从而又增加了 TCR 的多样性。最后不同的 和 β 链自由组合更增加了 TCR 的多样性，据理论估算可达到 1016以上，这也很好的解释了 T 细胞能够识别多种抗原的原因。TCR的 V区基因编码了CDR1、CDR2和部分CDR3区，VN(DN)J 连接区称之为 CDR3 区，它是识别抗原肽的关键区域[9]。通常我们只需得到特异性 T 细胞的 CDR3 区，根据 CDR3 区的部分 V 区和 C 区片段分析可得到 和 β 链的全长序列。每个 T 细胞的 和 β 链分别对应一个 CDR3 区，由 和 β 的 CDR3 区共同决定了识别抗原的特异性，通过 CDR3 序列可以判断 T细胞是否来自同一克隆或不同克隆。经过抗原刺激 TCR 谱系会出现优势选择，即识别该抗原的 T 细胞进行克隆性增殖[10]。通常多数研究只通过分析 TCRVβ 谱系来了解 TCR 选用和偏移情况，他们认为 Vβ 在抗原刺激后所引起的限制性更为明显，但也有学者认为 TCRV 的限制性出现更早，但有研究发现存在许多优势利用和优势配对情况，如 HLA-A2/Melan-A 特异的 CD8+T 细胞的 V 2.1NJ 35和 Vβ14.1 的选用和配对频率最高[11]，这也提示了在对抗原特异的 TCR 谱系研究中，可能需要同时分析 TCR 和 TCRβ 谱系，才能获得更为全面和客观的结果。
图 2 TCR β 基因的重排Fig.2 The rearrangement of TCR β genesCR 研究是利用 和 β 各亚家族相应单克隆抗体进行流各亚家族的分布与缺失进行研究。然而流式细胞术虽和 β 链各亚家族的表达并对其准确定量，却无法明确布，所以PCR-DNA印迹法[12]、PCR-变性聚丙烯酰胺凝性[14]、荧光定量 PCR 溶解曲线法[15]等方法应运而出CR 和 β 链 CDR3 多态性和长度分布。此后，有学者 TCRV 和 Vβ 基因家族同源性的特点研发了免疫扫疫指纹分析技术 )，其基本策略为依据 Vβ24 和 V 32 设计各家族相应的特异性上游引物，并在 TCR 和 β 和 TCRAC 下游引物，由于不同 T 细胞克隆其 TCR C，利用 PCR 技术可扩增出所有 TCRV 和 TCRVβ 家族
AG-3蔙:5
本文编号：2763362
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
也会有不同数量的核苷酸随机插入 V 区与 J 区、V 区与 D 区,D 区与 J 区，形成VN(DN)J 的重排，从而又增加了 TCR 的多样性。最后不同的 和 β 链自由组合更增加了 TCR 的多样性，据理论估算可达到 1016以上，这也很好的解释了 T 细胞能够识别多种抗原的原因。TCR的 V区基因编码了CDR1、CDR2和部分CDR3区，VN(DN)J 连接区称之为 CDR3 区，它是识别抗原肽的关键区域[9]。通常我们只需得到特异性 T 细胞的 CDR3 区，根据 CDR3 区的部分 V 区和 C 区片段分析可得到 和 β 链的全长序列。每个 T 细胞的 和 β 链分别对应一个 CDR3 区，由 和 β 的 CDR3 区共同决定了识别抗原的特异性，通过 CDR3 序列可以判断 T细胞是否来自同一克隆或不同克隆。经过抗原刺激 TCR 谱系会出现优势选择，即识别该抗原的 T 细胞进行克隆性增殖[10]。通常多数研究只通过分析 TCRVβ 谱系来了解 TCR 选用和偏移情况，他们认为 Vβ 在抗原刺激后所引起的限制性更为明显，但也有学者认为 TCRV 的限制性出现更早，但有研究发现存在许多优势利用和优势配对情况，如 HLA-A2/Melan-A 特异的 CD8+T 细胞的 V 2.1NJ 35和 Vβ14.1 的选用和配对频率最高[11]，这也提示了在对抗原特异的 TCR 谱系研究中，可能需要同时分析 TCR 和 TCRβ 谱系，才能获得更为全面和客观的结果。
图 2 TCR β 基因的重排Fig.2 The rearrangement of TCR β genesCR 研究是利用 和 β 各亚家族相应单克隆抗体进行流各亚家族的分布与缺失进行研究。然而流式细胞术虽和 β 链各亚家族的表达并对其准确定量，却无法明确布，所以PCR-DNA印迹法[12]、PCR-变性聚丙烯酰胺凝性[14]、荧光定量 PCR 溶解曲线法[15]等方法应运而出CR 和 β 链 CDR3 多态性和长度分布。此后，有学者 TCRV 和 Vβ 基因家族同源性的特点研发了免疫扫疫指纹分析技术 )，其基本策略为依据 Vβ24 和 V 32 设计各家族相应的特异性上游引物，并在 TCR 和 β 和 TCRAC 下游引物，由于不同 T 细胞克隆其 TCR C，利用 PCR 技术可扩增出所有 TCRV 和 TCRVβ 家族
AG-3蔙:5
本文编号：2763362
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