建立人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞

发布时间：2020-07-20 11:36

【摘要】：目的:诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)具有细胞来源广、可直接从病人自身获得、在体外可诱导分化为造血祖细胞的优点。本文探讨了如何建立了正常人外周血单个核细胞(PBMC)来源的诱导多能干细胞,为后期建立儿童遗传性血液病的诱导多能干细胞库奠定基础。方法:收集正常人外周静脉血,采用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficollhypaque)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,后将含有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个转录因子的仙台病毒转染单个核细胞,最后使转染病毒后的单个核细胞接种于由小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)组成的饲养层细胞上,通过观察形态学变化、TRA1-60活体染色、RTPCR对诱导多能干细胞进行检测。结果:外周血单个核细胞在转染仙台病毒后15天,干细胞样克隆开始逐渐形成,24天后可见大的圆形或椭圆形样、边界清晰的干细胞样克隆;细胞活体染色发现诱导多能干细胞可表达干细胞特异表面抗原TRA1-60,RT-PCR结果显示诱导多能干细胞可表达干细胞多能性相关基因Lin28、OCT4和Nanog。结论:将含有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个转录因子的仙台病毒转入人外周血单个核细胞,可以产生诱导多能干细胞,其形态特征与胚胎干细胞(ES)相似,可表达干细胞特异抗原TRA1-60,同时也表达干细胞多能性相关基因。这些结果为课题组后期建立儿童遗传性血液病诱导多能干细胞库以及同OP9系统共培养使其体外分化为造血祖细胞提供技术参考。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

图 1 外周血单个核细胞形态Fig 1 the morphology of PBMC.2 仙台病毒转染外周血单个核细胞产生 iPSCs.2.1 感染仙台病毒外周血单个核细胞培养第 4 天，感染仙台病毒。感染后第 3 天接种至饲养层EF 细胞上，六孔板每孔接种转染后细胞 1×104-5×104个。使用 PBMC 培养基每换液并观察细胞形态变化情况，转染病毒 5 天后，可见外周血单个核细胞增大。转病毒 3 天（×100） 转病毒 5 天（×100）

图 1 外周血单个核细胞形态Fig 1 the morphology of PBMC.2 仙台病毒转染外周血单个核细胞产生 iPSCs.2.1 感染仙台病毒外周血单个核细胞培养第 4 天，感染仙台病毒。感染后第 3 天接种至饲养层EF 细胞上，六孔板每孔接种转染后细胞 1×104-5×104个。使用 PBMC 培养基每换液并观察细胞形态变化情况，转染病毒 5 天后，可见外周血单个核细胞增大。转病毒 3 天（×100） 转病毒 5 天（×100）

图 3 干细胞样克隆开始形成（×100）Fig 3 stem cell like clones begin to emerge.2.3 干细胞样克隆与胚胎干细胞形态相似感染病毒后第 24 天，克隆增大，呈圆形或椭圆形样，岛状，边界与饲养分界清晰，克隆内有小的细胞生长，排列致密，细胞间分界不清，形态与细胞相似（图 4）。A 与 C 为同一细胞，B 与 D 为同一细胞。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 苏竞梅;;生殖衰老的生育困境(下)[J];人人健康;2017年09期

2 ;全球首例血液与大脑屏障建模成功[J];大众科学;2017年05期

3 王皓帆;;抑制p53-p21通路诱导多能干细胞的生成[J];中国病理生理杂志;2010年01期

4 王记;陆玉琴;徐鑫;纪召娟;;抑瘤素M促进小鼠诱导多能干细胞向心肌分化[J];基础医学与临床;2017年10期

5 夏朦;侯伟健;柏树令;敖强;;诱导多能干细胞的研究进展[J];中国民康医学;2015年14期

6 温玉琴;;研究发现诱导多能干细胞可用作癌症疫苗[J];广东药科大学学报;2018年01期

7 ;用诱导多能干细胞能再生完整皮肤[J];广州医科大学学报;2016年02期

8 ;诱导多能干细胞机理与技术研究:跻身世界先进行列[J];广东科技;2010年15期

9 孟媛;王红雷;任晓莉;刘丽;;小鼠胚胎成纤维细胞滋养层对小鼠诱导多能干细胞的作用研究[J];中国美容医学;2017年10期

10 蔡炳;脱颖;李宇彬;麦庆云;刘新颜;徐艳文;周灿权;;人卵泡壁层颗粒细胞源性非整合诱导多能干细胞的制备[J];生殖医学杂志;2017年04期

相关会议论文 前10条

1 新浪综合;;全球首例!用他人诱导多能干细胞治眼病[A];《科学与现代化》2018年第1期（总第074期）[C];2018年

2 严庆丰;;疾病特异性诱导多能干细胞研究[A];2015年浙江省医学遗传学学术年会暨高通量基因测序产前筛查与诊断技术研讨会论文汇编[C];2015年

3 李铮;胡洪亮;李朋;郭熙志;刘平;张伟;张玲玲;史占平;田汝辉;黄翼然;;诱导多能干细胞经体内外诱导向精子细胞分化研究[A];第十七届全国泌尿外科学术会议论文汇编[C];2010年

4 蒋春艳;董娟;廖婷婷;宁松;薛志刚;崔毓桂;刘嘉茵;范国平;曾桥;;建立人诱导多能干细胞系及向神经系统分化研究[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

5 蒋春艳;董娟;廖婷婷;宁松;范国平;曾桥;薛志刚;崔毓桂;刘嘉茵;;建立人诱导多能干细胞系及向神经系统分化研究[A];中华医学会第八次全国计划生育学术会议论文汇编[C];2012年

6 孙玉华;赵荧晖;任晓帅;邓怡;徐安秀;魏世成;;多肽修饰紫外交联甲基丙烯酸化透明质酸膜培养人诱导多能干细胞[A];第八届全国口腔材料学术交流会暨中华口腔医学会口腔材料专业委员会2013年会论文集[C];2013年

7 崔笑笑;崔亚洲;时良;栾静;周小艳;韩金祥;;诱导多能干细胞到破骨细胞分化的探索[A];第八届泛环渤海生物化学与分子生物学会2018年学术交流会论文集[C];2018年

8 李朋;杨施;胡洪亮;田汝辉;朱勇;马猛;黄翼然;何祖平;李铮;郭熙志;;诱导多能干细胞体外培养与重构生精小管诱导精子发生机制研究[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

9 齐自娟;崔亚洲;时良;栾静;周小艳;韩金祥;;诱导多能干细胞鉴定中启动子甲基化实验条件探索[A];2017第七届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集[C];2017年

10 张伟;丁慧;夏小雨;刘平;蔡恒;李朋;黄翼然;徐晨;李铮;;诱导多能干细胞生精小管移植向雄性配子分化潜能研究[A];第十六届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 本报记者 刘霞;诱导多能干细胞治心脏病，希望还是隐忧？[N];科技日报;2018年

2 记者 陈超 刘霞;全球首例!用他人诱导多能干细胞治眼病[N];科技日报;2017年

3 记者 范建;我科学家发现一个基因影响诱导多能干细胞质量[N];科技日报;2014年

4 杞人　朝胜;我科学家将诱导多能干细胞转化效率提高到10%[N];科技日报;2009年

5 本报记者 汪立乐;首例“超级供体”诱导多能干细胞株“安徽造”[N];中国产经新闻;2018年

6 记者 华义;用诱导多能干细胞能再生完整皮肤[N];科技日报;2016年

7 记者 张建列 通讯员 黄博纯;为高效获得诱导多能干细胞提供新思路[N];广东科技报;2016年

8 记者 白毅;人诱导多能干细胞构建再生牙齿获成功[N];中国医药报;2013年

9 记者 曹斯　实习生 李娇 朱璐诗 通讯员 朱丹萍;维C诱导多能干细胞效率提百倍[N];南方日报;2014年

10 记者 常丽君;用蛋白质制造诱导多能干细胞更加安全高效[N];科技日报;2012年

相关博士学位论文 前10条

1 华永泉;叶酸多肽水凝胶联合诱导多能干细胞移植治疗小鼠心肌梗死的作用及机制研究[D];南方医科大学;2018年

2 秦鼎新;肿瘤细胞来源的诱导多能干细胞研究[D];北京协和医学院;2010年

3 薛燕婷;尿液分离细胞来源非整合人诱导多能干细胞库的建立[D];中国科学技术大学;2013年

4 邸科前;小鼠雌性诱导多能性干细胞的分离与多能性研究[D];河北农业大学;2015年

5 刘锴;建立安全有效的猪的诱导多能干细胞[D];南开大学;2014年

6 刘静馨;癫痫病人诱导多能干细胞来源的神经元中Nav1.1突变效应及其致病机理研究[D];中国科学技术大学;2016年

7 张高川;诱导多能干细胞和肿瘤干细胞中致瘤基因的生物信息学分析[D];苏州大学;2014年

8 邓彦飞;水牛诱导多能干细胞的研究[D];广西大学;2012年

9 史慧君;高效制备绵羊诱导多能干细胞的研究[D];石河子大学;2015年

10 刘日渊;经腰椎穿刺注射干细胞内耳移植新途径的探索研究[D];中国人民解放军医学院;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘益;建立人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞[D];重庆医科大学;2018年

2 崔思颖;杜氏肌营养不良患胎绒毛来源非整合诱导多能干细胞的建立与鉴定[D];郑州大学;2018年

3 付尚峰;烧伤患者特异性非整合诱导多能干细胞的建立与鉴定[D];南昌大学;2018年

4 赵霞;血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响[D];重庆医科大学;2012年

5 殷欣;诱导多能干细胞转录因子在肝细胞癌复发及转移的作用研究[D];复旦大学;2011年

6 许士俊;小鼠诱导多能干细胞与PHBHHx膜体外共培养并制作心肌补片的实验研究[D];首都医科大学;2015年

7 陈皖娟;利用TALEN技术向人诱导多能干细胞引入癫痫相关SCN1A基因突变[D];安徽大学;2014年

8 瞿存业;重编程大鼠成纤维细胞为诱导多能干细胞[D];浙江理工大学;2010年

9 秦祯蔚;尿液来源的体细胞诱导多能干细胞的建立[D];浙江大学;2014年

10 严金梅;重型α-地中海贫血胎儿羊水来源的诱导多能干细胞系的建立及鉴定[D];广州医科大学;2017年

本文编号：2763394