铁离子通过ROS-乙酰化P53促巨噬细胞M1型极化

发布时间：2020-07-23 16:27

【摘要】：背景:巨噬细胞是机体免疫系统重要组成部分,它在铁代谢的调节中也起非常重要的作用。巨噬细胞通过最大限度的摄取、储存铁,并减少铁的排出,减少病原体所能利用的铁离子,从而限制其生长、增殖;同时,巨噬细胞利用胞质内的游离铁,通过芬顿反应产生大量活性氧物质,以杀灭被吞噬的病原体。另一方面,巨噬细胞内铁过载,也会改变巨噬细胞的极化状态,但是铁过载是如何促进巨噬细胞极化状态改变还缺乏相关研究。本研究旨在探讨铁过载通过何种途径对巨噬细胞极化状态产生影响,并运用这种效应,提出可能的相关疾病治疗方式。方法:使用DCFH-DA探针检测经铁剂处理后的巨噬细胞内ROS产生水平;采用WB、qRT-PCR、流式细胞术检测巨噬细胞极化标记物(IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10、CD206和CD86)表达水平;通过Western blot、qRT-PCR检测经铁剂处理后巨噬细胞p53及乙酰化p53表达水平;然后通过Western blot、qRT-PCR检测GSH和C646预处理对巨噬细胞p53表达及乙酰化、极化指标(TNF-α、CD206、Arg-1和iNOS)的影响;最后通过建立裸鼠皮下瘤模型(H22肝癌细胞:RAW264.7细胞=4:1,皮下注射)验证机体内铁过载对肿瘤内巨噬细胞极化状态的影响。结果:荧光显微镜观察的DCFH-DA探针显示,与对照组相比,经铁剂处理2小时后的巨噬细胞内产生大量ROS,而同时使用GSH+铁剂处理的巨噬细胞内并未见到大量ROS产生。同时,使用Western Blot、qRT-PCR和FCM检测,发现对照组和GSH+铁剂处理组相比,仅使用铁剂处理的巨噬细胞内IL-1β、TNF-α、iNOS、CD86表达明显升高(P0.01),TGF-β、IL-10、CD206表达无明显差异(P0.05);另外,Western Blot和q RT-PCR检测结果发现仅使用铁剂处理组巨噬细胞内p53表达较对照组和GSH+铁剂处理组明显升高(P0.05)。随后,我们使用相同浓度铁剂,对巨噬细胞处理不同时间(0-8小时),经Western Blot、qRT-PCR检测证实p53表达随处理时间增加而升高(P0.05)。随后,我们检测了p53乙酰化水平,经Western Blot证实,p53乙酰化水平也随铁剂处理时间增加而升高。然后,我们使用C646抑制p53的乙酰化,并通过Western Blot检测p53乙酰化抑制效应,证实C646+铁剂处理组能够明显抑制p53的乙酰化(P0.01,与铁剂处理组相比),同时,还发现GSH+铁剂处理组巨噬细胞p53乙酰化也明显低于铁剂处理组(p0.01),但是高于对照组(P0.05)。Western Blot、qRT-PCR检测发现C646+铁剂处理组IL-1β、TNF-α、iNOS表达较铁剂处理组低(P0.01),与对照组无明显差异(P0.05)。最后,我们使用H22鼠源性肝癌细胞系及RAW264.7鼠源性巨噬细胞系按4比1的比例行裸鼠皮下成瘤,10只裸鼠均在成瘤前接受尾静脉柠檬酸铁溶液注射(铁剂组)或生理盐水注射(对照组)。皮下细胞系注射后第3天开始测量肿瘤体积,于第21天完整取下肿瘤(每组均成瘤4只),称量肿瘤质量。经统计计算后,发现铁剂组小鼠皮下瘤与对照组相比生长相对缓慢,完整皮下肿瘤质量小于对照组(P0.01)。皮下瘤冰冻切片,使用免疫组织荧光染色,发现铁剂组与对照组皮下瘤组织内F4/80表达无明显差异,但铁剂组CD86表达明显增加。同时,我们使用超氧化物阴离子荧光探针检测肿瘤组织内活性氧产生水平,发现铁剂组皮下瘤组织内有更多的ROS产生。结论:巨噬细胞内铁过载能促进ROS生成,该现象可能通过芬顿反应实现,即Fe~(2+)+H_2O_2→Fe~(3+)+OH~-+OH·。在ROS大量产生的同时,巨噬细胞向M1型极化;使用GSH减少巨噬细胞内ROS的含量,巨噬细胞M1型极化也减弱,提示铁过载通过促进ROS的产生,诱导了巨噬细胞M1型极化。在随后的实验中,使用Western blot,qRT-PCR检测显示p53表达及乙酰化都随铁剂处理时间延长而增加,而通过GSH抑制ROS后,铁剂处理促进p53表达和乙酰化增加的效应减弱;使用C646抑制p53的乙酰化后,铁剂促巨噬细胞M1型极化也减弱。这些结果说明,乙酰化p53也参与了铁过载促巨噬细胞的M1型极化。所有的研究结果显示,巨噬细胞内铁过载可能通过促进ROS产生,增加p53乙酰化转移酶活性,诱导p53表达及乙酰化,最终导致巨噬细胞M1型极化。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

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图 2 ROS 诱导 p53 蛋白表达A：Western blot 检测铁剂刺激后不同时间巨噬细胞内 p53 蛋白的表达；B：qRT-PCR 检测铁剂刺激不同时间后巨噬细胞内 p53 RNA 的表达 a:P＜0.01 与 0 h 比较；b：P＜0.01，与 2h比较；c：P＜0.01，与 4h 比较；C：Western blot 检测巨噬细胞内 p53 蛋白的表达；D：qRT-PCR检测巨噬细胞内 p53 RNA 的表达；a：P＜0.01，与 Control 组比较；b：P＜0.01，与 Iron +GSH 组比较。Figure 3. ROS production induced p53 expression.(A, B) Western-blotting and qRT-PCR showed that iron induced the expression of p53and p21 in a time-dependent manner (P＜0.01),a:P＜0.01 vs 0h, b:P＜0.01 vs 2h, c:P＜ 0.01 vs 4h. (C) Western-blotting and qRT-PCR showed that NAC repressed p53expression (P＜0.01), a:P＜0.01vs control,b:P＜0.01vs Iron+GSH.3.3 ROS 诱导 p53 乙酰化，抑制 p53 乙酰化逆转铁离子的促 M1 型

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重庆医科大学硕士研究生学位论文发现，p300/CBP 抑制剂能够明显抑制 p53 的乙酰化，但并不影响 p53 的表达，而GSH 则同时抑制 p53 表达和乙酰化(图 3C、D)。随后，再通过 Western blot、qRT-PCR 检测巨噬细胞极化的标记物，发现 p300/CBP 抑制剂和 GSH 都能够抑制铁剂刺激引起的 M1 型极化(图 3E、F)。这些结果说明 ROS 可能通过乙酰化 p53来调控铁剂诱导的 M1 型极化。

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