基因重组蛋白诱导多能干细胞基础研究

发布时间：2020-07-23 03:01

【摘要】：第一部分 带有穿膜肽重组PTD-Oct4-6His的制备及活性鉴定 目的基因重组构建具有穿膜活性转录因子PTD-Oct4-6His蛋白的原核表达系统。方法利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒PKYB-PTD-Oct4,并转化至Ecoil ER2566。镍柱层析纯化重组蛋白并用Western bloting鉴定。用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记PTD-Oct4检测其穿透中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞细胞膜的能力；用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)检测重组融合蛋白PTD-Oct4结合目的DNA的活性。结果成功获得目的蛋白PTD-Oct4,其可以成功进入细胞、定位细胞核内,穿膜效率为28.3±2.4%,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。结论本研究为制备重组PTD-Oct4并将其作为外源蛋白诱导靶细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)奠定基础。 第二部分 小鼠角膜基质细胞的原代培养 目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法,为角膜基质细胞生物学、利用小鼠角膜基质细胞诱导转化为IPS细胞、角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法+组织块法分离培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光细胞化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接；免疫荧光组织化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性；RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论Dispase酶消化法+组织块法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。 第三部分 基因重组构建真核Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc表达系统及其在小鼠角膜基质细胞中的表达 目的基因重组构建具有穿膜活性的核转录因子Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc的真核表达系统,将其转染至小鼠角膜基质细胞,检测其在小鼠角膜角质细胞中的表达。方法利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒,测序检测重组DNA序列是否克隆正确。确定正确序列后将其转染至小鼠角膜基质细胞。倒置显微镜下观察细胞生长情况,转染后第10d免疫组织化学鉴定其表达。结果成功构建质粒PCDNA3.1-Sox2、PCDNA3.1-Oct4、PCDNA3.1-Klf4、PCDNA3.1-c-Myc;测序结果显示对应基因序列正确,可成功转染至小鼠角膜基质细胞中；引起细胞形态变化,荧光免疫组织化学染色检测转染后第10d其在小鼠角膜基质中表达。结论成功构建4个核转录因子的真核表达系统,可转染至小鼠角膜基质细胞及引起细胞形态和表型的变化,本研究为真核重组外源蛋白诱导角膜基质诱导转化为IPS细胞奠定基础。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】

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