MERS-CoV中和抗体的筛选及人源化抗体的设计

发布时间：2020-07-24 11:18

【摘要】：新发现的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome coronavirus, MERS-CoV)能够引起人类严重甚至致命的呼吸系统疾病,其致死率超过SARS病毒(-10%),达到37%。然而迄今为止没有有效的治疗和预防方法。中和抗体在多种病毒感染中可以保护宿主免受病毒感染,减缓疾病进程,减轻临床症状。因此,中和抗体具有重要临床应用的价值,能够为未来可能发生的大流行提供重要的战略储备。MERS-CoV的侵染主要依赖于病毒表面的囊膜蛋白S糖蛋白中的受体结合区(Receptor binding domain, RBD)与受体二肽基肽酶(DPP4,又称CD26)之间的相互作用。MERS-RBD主要负责病毒识别受体并与之结合。因此,RBD是MERS-CoV的主要抗原表位。本研究中,利用杂交瘤细胞技术以RBD为免疫原成功筛选出RBD特异的单克隆抗体2E6和4C2。抗体2E6和4C2能够阻碍RBD蛋白与受体CD26的结合并进一步抑制MERS假病毒感染,其ICs0值分别为0.477μg/mL (～3.18 nM),1.4 μg/mL(～9.33nM)。通过表面等离子共振技术检测2E6和4C2抗体与MERS-RBD结合的亲和力分别为76 nM和138 nM。利用Octet RED96生物分子相互作用分析仪确定了4C2与2E6结合抗原时存在竞争关系。通过解析4C2和MERS-RBD的复合物结构,阐明了4C2的中和机制主要是由于4C2与MERS-RBD结合形成空间位阻及4C2竞争性结合CD26与MERS-RBD结合界面的氨基酸。根据结构对4C2进行了人源化改造并初步验证了抗体人源化后的效果。实验结果表明抗体2E6、4C2以及4C2人源化抗体(4C2h)都是针对RBD的有效抑制剂,有希望可以作为预防和治疗MERS冠状病毒感染的候选抗体。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【图文】：

示意图,示意图,高变区,可变区

抗体的结构逡逑体发挥功能的基本单位是一个免疫球蛋白单体，ＩｇＧ由四条多肤链组成，链为重链，Ｗ两条短链为轻链。而控链和重链之间通过二硫键连接所形物结构如图＾７所示。逡逑Ｇ包含了两个抗原结合的位点，单价的臂片段（Ｍｒ邋４５邋ｋＤａ）称为Ｆａｅｎｔ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｉｎｄｉｎｇ），是识别外来物的关键所在。重链和轻链的Ｆ化区段可变区与一恒定区。可变区又称为Ｆｖ区，是与抗体结合的最关键区域，区的互补位成型于抗体单体氨基酸链的末端，该区域称为互补决定ｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ邋Ｒｅｇｉｏｎ，邋ＣＤＲ）邋［６９］，也称做高变区，是真正的部位。高变区被框架区（Ｆｒａｍｅ邋Ｒｅｇｉｏｎ，邋ＦＲ）隔开，ＦＲ区氨基酸序列。ＩｇＧ基部与它的Ｆａｂ臂的连接处称为较链区（ｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎ），长度约为３

抗体多样性,分子机制,可变区,抗体

可变区的变化使该抗体可和某一个特定的抗原结合［７２］。Ｂ细胞通过Ｖ、Ｄ、Ｊ重逡逑排产生具备功能的蛋白后，因为等位基因排斥，不能产生其它形状的可变区。如逡逑图１－８所示，每一个Ｂ细胞仅能产生某一种相同可变区的抗他气抗体的免疫多样逡逑性使其在免疫过程中发挥重要作用。因此，抗体的治疗作用不容忽视。逡逑Ｖｎ．２．．．ｎ）逦Ｃ逦Ｖ（１，２．．．ｎ）邋Ｄ（ＶＩ２）逦Ｃ逡逑

曲线,竞争性结合,仪器检测,抗原表位

为进一步确定抗体２Ｅ６和４Ｃ２是否竞争性结合ＭＥＲＳ－ＲＢＤ，运用Ｏｃｔｅｄ邋ＲＥＤ逡逑％分子相互作用分析仪进行分析。首先将纯化的ＭＥ艮Ｓ－ＲＢＤ固定在芯片表面，逡逑再分别与两种抗体结合。如图３－５所示。其中深踪色的表示ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在结合有逡逑２Ｅ６Ｆ化时再结合４Ｃ２Ｆ化，结合曲线变化很小；浅踪色的表示ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在没有逡逑结合２Ｅ６Ｆ化时结合４Ｃ２Ｆ化，结合曲线有明显升高，这表明ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在结合有逡逑２Ｅ６Ｆ化的情况下其结合４Ｃ２Ｆ化的能力明显下降。同样地，其中深栋色的表示逡逑ＭＥ艮Ｓ－ＲＢＤ在结合有４Ｃ２Ｆ化时再结合２Ｅ６Ｆａｂ，结合曲线变化很小；浅踪色的表逡逑示ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在没有结合４Ｃ２Ｆ化时结合２Ｅ６Ｆ化，结合曲线有明显升高，表明逡逑ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在结合有４Ｃ２Ｆ化的情况下其结合２Ｅ６Ｆａｂ的能力明显下降。结果说明

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