Vav-iCre启动子介导的自噬基因特异性敲除对小鼠造血系统影响的初步研究

发布时间：2020-07-24 08:13

【摘要】：目的:本文旨在探索造血系统特异性敲除beclin1双等位基因后,对胚胎期造血器官肝脏及骨髓的影响,对骨髓造血干祖细胞数量及功能的影响,对各类功能性血细胞的影响。方法:(1)构建造血系统特异性敲除beclin1双等位基因的小鼠模型。采用造血系统特异性表达的Vav启动子,启动Cre酶的表达,实现特异性敲除beclin1基因的第四号外显子到第七号外显子之间的序列,实现移码突变,使beclin1基因功能丧失。(2)利用聚合酶链式反应(PCR)对从鼠尾中提取的基因组DNA进行扩增,通过琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。(3)将beclin1~(f/f)小鼠与beclin1+/f;Vav-iCre小鼠(本文简写为beclin1+/f)进行杂交,对孕鼠进行麻醉脱臼处死,剖腹产取出围产期18.5天的胎鼠进行相关实验。(4)通过苏木精-伊红染色法(HE染色法)检测胎鼠肝脏的病理学变化。将胎肝取出后置于4%多聚甲醛(PFA)中进行固定,或将整只胎鼠置于4%PFA中进行固定,检测造血系统beclin1双等位基因的敲除对胎肝等造血器官的影响。(5)通过三分类全自动血液分析仪对胚胎期18.5天的胎鼠外周血中各类血细胞指标进行检测。(6)通过多色流式细胞分析仪对18.5天的胎鼠骨髓中的造血干细胞及造血祖细胞群的数量和比例进行检测分析。(7)通过体外克隆形成实验(CFU)对胚胎期18.5天的胎鼠骨髓中长程造血干细胞及单个核细胞的克隆形成能力进行检测。结果:(1)我们首先成功构建了beclin1~(f/f)小鼠以及beclin1+/f;Vav-iCre小鼠,将两种基因型小鼠杂交,所产生的子代中有基因型为beclin1~(f/f);Vav-iCre(本文简写为beclin1-/-)的小鼠,即造血系统中beclin1双等位基因敲除的胎鼠。由于纯合敲除小鼠在围产期18.5-19.5天全部死亡,我们选取胚胎期18.5天的胎鼠进行后续功能检测。(2)beclin1~(f/f);Vav-iCre胎鼠的鼠尾基因组DNA,通过基因型鉴定可以检测出基因敲除条带,表明beclin1被成功敲除;凡是不带Vav启动子的小鼠即野生型小鼠(本文简称为WT)无敲除条带。(3)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠与野生型小鼠相比,体型偏小,颜色发白。(4)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠,胎肝的中央血管中红细胞数量稀少,血窦不丰富,含有数量较多的有核细胞,存在髓外造血。肝脏在胚胎期15.5天开始出现缺血性坏死灶,在肝脏外观上表现为白色斑块。(5)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠外周血中,白细胞和淋巴细胞计数增多,红细胞计数显著减少并且红细胞指标异常,血小板计数增多但血小板功能异常。(6)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠骨髓中造血干祖细胞群比例明显降低。(7)CFU实验表明胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre胎鼠,骨髓中的长程造血干细胞及单个核细胞均失去克隆形成能力,骨髓造血重建能力严重受阻。结论:造血系统特异性敲除beclin1双等位基因的小鼠,由于造血功能衰竭,导致纯合敲除小鼠在围产期全部死亡。纯合敲除小鼠骨髓中的HSCs比例显著降低,并且骨髓中HSCs造血重建能力严重受阻,完全分化的功能性血细胞计数及其参数异常。这些结果表明了Beclin1在胚胎期造血中的重要作用。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363
【图文】：

验结果 Vav-iCre 启动子介导的自噬基因特异性敲除对小鼠造血系统影响的初步活。从而提示 beclin1-/-小鼠在胚胎期 18.5 天至胚胎期 19.5 天之间死亡。于妊 18.5 天对孕鼠麻醉颈椎脱臼处死后，剖腹产取出胎鼠，发现 beclin1-/-胎鼠体显减小，身体发白（图 2），推测造血系统中特异性敲除 beclin1 双等位基因胎鼠产生严重的贫血症状。

lin1f/f与 beclin1+/f;Vav-icre 亲本杂交所获得的 600 多只胎鼠的基因型，19.5 天出生小鼠中无 beclin1-/-基因型小鼠，各基因型比例 WT：be-/-=67.7%：32.3%：0.0%；胚胎期 18.5 天的胎鼠各基因型比例 WT：bebeclin1-/-=51%：26.2%：22.4%。

图 3. beclin1f/f;Vav-iCre 胎鼠体型偏小，颜色发白A）胚胎期 18.5 天野生型小鼠肝脏切片中血窦丰富，beclin1-/-小鼠的肝脏中中央血管中红细胞数量稀少，血窦减少，有核细胞（黑色箭头所指）明显增多（上方切片放大倍数为 20 倍，下方切片放大倍数为 40 倍）；B）通过流式细胞分析仪对胎肝细胞及骨髓细胞中的有核细胞进行检测，发现肝脏中该细胞比例增多，但骨髓中的有核细胞比率无差异。** P < 0.01

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本文编号：2768561