有机溶质转运体OSTα的可变剪接体的表达和细胞内作用

发布时间：2020-07-24 13:32

【摘要】：目的1检测可变剪接体OSTα2在不同动物(家兔、小鼠、大鼠)和人的组织表达谱;检测胆汁淤积或者胆汁酸负荷时,以及肥胖和高脂饮食引起的脂代谢异常时OSTα与OSTα2的表达改变。2检测可变剪接体OSTα2对OSTα与OSTβ的相互作用及膜定位的影响。方法1利用PCR、半巢式PCR定性检测不同动物和人组织中OSTα和OSTα2的表达情况;利用实时定量PCR检测胆管结扎或口服胆汁酸负荷时,以及肥胖和高脂饮食引起的脂代谢异常时小鼠回肠OSTα及OSTα2的表达改变。2利用PCR技术扩增小鼠OSTα、OSTα2和OSTβ的编码序列,克隆到表达载体pc DNA3.1(-)中。基因编码序列克隆入载体p Bi FC-VC155和p Bi FC-VN155以进行Bi FC分析,克隆入p EGFPN2构建GFP融合蛋白。利用Bi FC和GFP融合蛋白分析蛋白的相互作用与膜定位。结果1 PCR定性检测显示OSTα和OSTβ在所有检测组织中均有表达,OSTα2在除卵巢外的所有检测组织表达。提取各组小鼠回肠RNA,逆转录后实时定量PCR分析显示:胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)后OSTα、OSTα2及OSTβ的表达水平在3天(BDL3d)组均显著降低,OSTβ的表达水平在BDL7d组也明显降低;牛磺胆酸(taurocholate acid,TCA)处理后,OSTα在TCA10d和TCA20d表达水平显著升高,而OSTα2及OSTβ的表达水平仅在TCA10d组明显升高;消胆胺(cholestyramine,CY)处理组变化不明显;与对照的db/m小鼠相比,db/db小鼠回肠OSTα和OSTα2的m RNA表达水平均升高;高脂饮食喂养3个月所致的营养性肥胖小鼠,实时定量PCR结果显示OSTα在回肠的表达显著高于对照组;回肠OSTα2表达水平没有明显改变。2利用Bi FC技术和GFP融合蛋白分析,共聚焦显微镜下结果显示:OSTα和OSTβ共表达绿色荧光定位于细胞膜;OSTα2单独表达形成的同源二聚体定位于胞浆;OSTα2和OSTβ可形成异二聚体,但绿色荧光定位于胞浆中;OSTα和OSTβ中加入等量OSTα2后,绿色荧光主要定位于细胞浆中。结论1胆总管结扎小鼠回肠OSTα、OSTα2及OSTβ表达降低,而胆汁酸负荷小鼠回肠的OSTα、OSTα2及OSTβ表达增加。2 OSTα2通过与OSTα竞争结合OSTβ,干扰OSTα-OSTβ复合物的形成以及亚细胞定位和功能,表现为显性负效应。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363
【图文】：

剪接位点,轻弹

图 1 跨剪接位点设计引物Fig.1 Primers designed for cross splicing sites荧光定量 PCR 检测步骤有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反应体系：SYBR-G4μl；下游引物 0.4μl；待测样品 cDNA 4μl；ddH2O 5.2μl；壁做好分组标记，避光且冰上加样，轻弹管底将溶液混合，al-time PCR 仪开机预热 30min，将配置好的 PCR 反应溶液置行实时定量扩增反应。反应条件设置为：95 ℃ 2min 预变性2 ℃ 20s，共 40 个循环；最后 95℃ 15s 延伸后退火。泳检测：目的基因和内参基因进行 Real-time PCR 反应后，r 进行 1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定 PCR 产物是否为单一特异果

小鼠,表达水平,比值

图 4 胆总管结扎小鼠回肠 OSTα 的表达改变Fig.4 Changes of ileal OSTα expression in mice following common bile duct ligation注：OSTα 和 OSTα2 在 TCA10d 组及 TCA20d 组的表达均明显增高；OSTβ 的表达水平在 TCA10d 组也显著升高，OSTα2/OSTα 比值在 TCA10d 组及 TCA20d 组降低（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n=6）。图 5 TCA 处理小鼠回肠 OSTα 的表达改变Fig.5 Changes in the expression of ileal OSTα in TCA treated mice

相互作用,细胞膜,红色荧光,氨基酸残基

YFP）的变异体 Venus 蛋白的 1-155 氨基酸残基（VN）融合到 OSTα 的 C 端，将Venus 蛋白的 156-238 氨基酸残基（VC）融合到 OSTβ 的 C 端。当 OSTα 与 OSTβ相互作用使得 Venus 蛋白重建，可发出绿色荧光。共聚焦显微镜下观察结果显示，OSTα-VN+OSTβ-VC 绿色荧光与红色荧光重叠显示黄色荧光，说明二者结合定位于细胞膜，符合其作为转运体的功能定位（图 8A）；OSTα2-VN+OSTα2-VC 绿色荧光定位于胞浆，说明 OSTα2 可以形成同源二聚体，但不能定位到膜上行使功能性作用（图 8B）；OSTα2-VN+OSTβ-VC 绿色荧光定位于胞浆中，与细胞膜染料的红色荧光不重叠，说明 OSTα2 可与 OSTβ 形成复合体，但该复合体不能转位至细胞膜执行转运体功能（图 8C）；OSTα-VN+OSTβ-VC+OSTα2 绿色荧光主要定位于细胞浆中，仅少量定位于细胞膜（图 8D）。

【参考文献】