研究不同培养模式对间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响及机制

发布时间：2020-07-25 07:57

【摘要】：1.目的:通过研究间充质干细胞(MSC)在不同共培养模式下对造血干细胞(HSC)体外增殖的影响,并探究其机制,从而尽可能真实地模拟体内HSC增殖的骨髓微环境,寻找更好的促进HSC体外增殖的方法。方法:1.C57小鼠MSC分离、培养:采用全骨髓培养法,将C57BL/6小鼠骨髓细胞,在胎牛血清含量为10%、青-链霉素含量为1%、DMEM-F12含量为89%的培养基中培养,第一个48h行半量换液,此后每隔2天行全量换液一次,于倒置相差显微镜下动态对细胞的形态变化及生长情况进行观察。至培养瓶底面的细胞长至约90%融合时,按1:2比例传代。连续观察P0、P1、P2、P3代MSC生长情况、形态变化。2.GFP小鼠HSC的分离、鉴定:通过密度梯度离心,获得稀释液层下的小鼠骨髓单个核细胞(MNC),MACS-CD117+磁珠分选HSC。应用流式细胞计数仪(FACS)检测CD117阳性细胞的纯度。3.间充质干细胞促进造血干细胞增殖的研究:设置对照组:HSC组(24孔板内单独接种造血干细胞)、MSC组(24孔板内单独接种间充质干细胞);实验组:Transwell共培养组(24孔板对应规格Transwell内单独接种造血干细于上室、间充质干细胞于下室)、2D接触共培养组(24孔板共同接种造血干细胞与间充质干细胞)。体外培养7天,观察HSC生长情况、形态变化、进行细胞计数、并绘制生长曲线、Cell Counting Kit(CCK-8)法测定HSC扩增情况。测定各个组MSC细胞数量,ELISA法测定细胞培养液中SDF-1及VFGF的表达情况。结果:1.C57BL/6小鼠的MSC的分离培养:倒置显微镜下观察原代培养5天开始出现梭形贴壁细胞,约第12天梭形细胞融合度可达90%-95%。传代后细胞贴壁生长较快,多在24 h内贴壁。传至第3代后6-7天可生长达80%融合并呈长梭形密集排列。间充质干细胞经传代后的细胞纯度逐渐升高。2.GFP小鼠的HSC的分离鉴定:实验中平均每只GFP小鼠的骨髓细胞液经密度梯度离心后可以获得约5.5×107个单个核细胞,经台盼蓝染色计数活性细胞率为97%。MNC经MACS CD117磁珠分选后,平均可以获得约1.3×105个CD117+细胞,活细胞率为98%。骨髓MNC中CD117+细胞含量约0.24%。荧光显微镜下可见HSC呈圆形,并可激发出绿色荧光,大小均一。流式鉴定结果显示,磁珠分选后的CD117+HSC纯度为99.51%。3.不同培养模式下间充质干细胞对造血干细胞增殖的影响:(1)镜下观察MSC对HSC增殖的影响:荧光显微镜观察显示:各组HSC细胞数量随着共培养时间的延长而增多,且2D共培养组荧光细胞数量较其他组明显增多;(2)计数法检测MSC对HSC增殖的影响:对细胞计数进行分析:共培养第1天,3组HSC活性细胞数量与接种时(d0)比较,HSC组(control group,单独培养HSC组)与接种时比较,差异没有统计学意义(P=0.151);Transwell共培养组与接种时比较,P=0.010;2D共培养组与接种时比较,P=0.002。共培养第1天比较3组中HSC数量,HSC单独培养组与Transwell组比较,差异没有统计学意义(P=0.718);2D组高于HSC单独培养组,P=0.000;2D组高于Transwell组,P=0.0000。共培养第3天,3组间HSC细胞数量比较,Transwell共培养组高于HSC单独培养组,P=0.004;2D共培养组高于HSC单独培养组,P=0.002;2D共培养组高于Transwell共培养组,P=0.010。共培养第5天,3组间HSC细胞数量比较,Transwell共培养组高于HSC单独培养组,P=0.039;2D共培养组高于HSC单独培养组,P=0.001;2D共培养组高于Transwell共培养组,P=0.000。共培养第7天,3组间HSC细胞数量比较,Transwell共培养组高于HSC单独培养组,P=0.001;2D共培养组高于HSC单独培养组,P=0.000;2D共培养组高于Transwell共培养组,P=0.000。(3)CCK-8法检测HSC增殖:对1、3、5、7天HSC样本进行CCK-8检测OD值,从生长曲线可以看出,随培养时间的延长各组HSC数量均随之增加,第3天开始HSC细胞进入对数生长期,与MSC共培养对HSC增殖有促进作用,2D共培养模式较Transwell共培养的促进作用更明显。共培养第一天,HSC单独培养组与Transwell共培养组比较,差异没有统计学意义(P=0.151);HSC单独培养组与2D共培养组比较,差异没有统计学意义(P=0.054)。共培养3-7天,共培养组细胞增殖明显高于HSC单独培养组,P0.05;且2D共培养组明显高于Transwell共培养组,P0.05。4.不同培养模式下,间充质干细胞促进造血干细胞增殖可能的机制:(1)培养第7天,采用双抗体夹心ELISA法检测培养液中SDF-1含量,结果显示:2D组高于HSC单独培养组,P=0.000;Transwell组高于HSC单独培养组,P=0.000;2D组高于MSC单独培养组,P=0.000;Transwell组高于MSC单独培养组,P=0.000;2D组高于Transwell组,P=0.017。(2)培养第7天,采用双抗体夹心ELISA法检测培养液中VEGF含量,结果显示:2D组高于HSC单独培养组,P=0.0000;Transwell组高于HSC单独培养组,P=0.000;2D组高于MSC单独培养组,P=0.000;Transwell组高于MSC单独培养组,P=0.000;2D组高于Transwell组,P=0.009。(3)计数法检测共培1、3、5、7天各组MSC数量,结果显示:MSC细胞数量随培养时间的延长而增加,自第3天进入对数生长期,2D和Transwell共培养组的MSC数量均高于MSC单独培养组,2D共培养组细胞数量高于Transwell共培养组,以第7天最为明显。(4)对第7天HSC细胞数量、MSC细胞数量、SDF-1含量、VEGF含量进行相关性分析,结果显示:SDF-1、VEGF与HSC、MSC细胞数量间呈明显正相关(P0.05)。结论:1.与间充质细胞进行共培养的造血干细胞的增殖能力强于单独培养的造血干细胞,且2D接触共培养的模式对造血干细胞增殖的促进作用优于非接触共培养模式。2.2D接触共培养模式促进造血干细胞增殖作用更强的机制可能有以下几点:(1)MSC与HSC在2D接触共培养模式下,分泌了更多的血管生成因子(VEGF)和趋化因子(SDF-1)。(2)SDF-1和VEGF的分泌具有相关性,共同促进了HSC和MSC的增殖。(3)HSC对MSC增殖的具有促进作用,MSC的增殖能力在接触共培养模式下较非接触共培养模式更强,增殖的MSC进一步促进了HSC的增殖,从而形成良性循环,增强了HSC的增殖能力。3.相较于HSC单独培养模式和非接触共培养模式而言,2D接触共培养模式能模拟一个更加接近于自然状态下的骨髓微环境,因此更加有利于造血干细胞的体外增殖。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

图 1 分离出的小鼠股骨（箭头标示处可见股骨头完好）Figure 1 Theisolated mouse femur图 2 分离出的小鼠胫骨Figure 2 The isolated mouse tibia(The arrow mark shows the femoral head intact visible)4.1.2 原代培养（1）将细胞悬液吹打混匀并计数细胞后，调整细胞密度为 1×107个/ml，每瓶 3ml 细胞悬液，接种于 25cm 培养瓶中。置于 37 ℃、5 ％CO2饱和湿度的孵箱中培养。将这代细胞标记为 P0 代细胞。（2）接种细胞后 48 小时半量换液一次。吸取上层培养基 1.5ml，弃于废液桶，并加入新鲜培养基 2ml，吹打混匀。以后每 48h 全量换液

图 1 分离出的小鼠股骨（箭头标示处可见股骨头完好）Figure 1 Theisolated mouse femur图 2 分离出的小鼠胫骨Figure 2 The isolated mouse tibia(The arrow mark shows the femoral head intact visible)4.1.2 原代培养（1）将细胞悬液吹打混匀并计数细胞后，调整细胞密度为 1×107个/ml，每瓶 3ml 细胞悬液，接种于 25cm 培养瓶中。置于 37 ℃、5 ％CO2饱和湿度的孵箱中培养。将这代细胞标记为 P0 代细胞。（2）接种细胞后 48 小时半量换液一次。吸取上层培养基 1.5ml，弃于废液桶，并加入新鲜培养基 2ml，吹打混匀。以后每 48h 全量换液

图 3 分离出的 GFP 小鼠腿骨（可见股骨头完好，肌肉组织呈绿色Figure 3 Isolated GFP mouse leg (visible femoral head intact, muscle tissugreen)2.2 密度梯度离心法获取小鼠骨髓 MNC1）将获得的细胞悬液混匀，滤网过滤去除骨渣。1200 r 离心去上清液，用 1.5 mlPBS 重悬并吹打混匀。2）小鼠 Ficoll 分离液提前复温，移液管吸取 2 ml 加入离心用移液枪沿管壁缓慢注入上述已混匀的细胞悬液，细胞悬液，避免 2 者混合，可见明显的分界线。（图 4）20 ℃、400 min。

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