脊髓灰质炎病毒2C蛋白的结构与功能研究

发布时间：2020-07-26 15:25

【摘要】：脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)是脊髓灰质炎的病原体,可侵犯中枢神经系统,损害脊髓前角运动神经细胞。PV属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus,EV),它的基因可以编码一个约250 kDa的前体蛋白(polyprotein)。病毒前体蛋白被自身的蛋白酶2A和3C切割形成11个成熟的具有功能的蛋白,其中包括4种结构蛋白(衣壳蛋白):VPO,VP1和VP3,以及7种非结构蛋白:2A,2B,2C,3A,3B,3C和3D。非结构蛋白2C及其前体蛋白2BC介导了病毒感染的细胞中膜组分的变构与基于膜结构的病毒复制复合物的组装,此外,还参与了包括病毒的脱衣壳、天然免疫逃逸和病毒衣壳的形成等病毒生命周期中的重要过程。2017年关洪鑫博士等解析了EV71 2C 116-329的结构,这项研究成果填补了多年来2C结构信息方面的空缺。本课题成功解析了 PV2C116-329的2.55A的高分辨率晶体结构,这是我们继EV71后解析的第二个微小核糖核酸病毒科的2C蛋白结构。解析的2C蛋白结构当中包含三个subdomain:ATPase结构域,锌指结构域和一个长的C末端两亲性α螺旋(或pocket binding domain,PBD)。其中ATPase结构域和锌指结构域之间的疏水氨基酸形成了一个疏水性的“口袋(pocket)”。这两个结构的不同之处在于锌指结构的构造,EV71的锌指有三个配体,而PV的锌指结构有四个配体。与EV712C蛋白的结构相似的是,PV 2C的C末端两亲性α螺旋通过疏水相互作用与相邻的一个2C蛋白的疏水性“口袋”相互结合,在晶体中同样是以多聚体的形式存在;与此同时分子筛柱层析的实验结果表明PV2C在溶液中是以四聚体的形式存在的。我们挑选了参与构成三个结构域的关键氨基酸进行单点突变,检测其突变体的ATPase酶活性,结果表明这种寡聚化形式是2C蛋白发挥ATPase活性的结构前提。我们知道AAA+ATPase超家族的蛋白通常会形成环状六聚体结构来行使功能,2C蛋白属于该家族成员,并且电镜学研究也表明2C蛋白可以形成环状结构,因此我们推测PV 2C也会形成环状六聚体结构。我们以SV40 Large TAntigen(LTAg)的六聚体为模版,参考EV71 2C 116-329的六聚体模型,模拟构建了 PV2C的六聚体模型。并且我们以该模型为模版,把之前发现的所有的与功能相关的位点以及抑制剂抗性位点都定位到了这个六聚体模型上,这便为进一步深入探讨2C的功能提供了重要的结构生物学基础,同时这个研究成果也将为设计靶向2C抑制剂研发提供了重要的科学依据。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373
【图文】：

图１微小ＲＮＡ病?

２肠道病毒属和口蹄疫病毒属的病毒多聚蛋白剪切。病毒ＲＮＡ与病毒编码（ｖｉｒｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＶＰｇ）在其５＇端连接。开放阅读框（ＯＲＦ）编码一个多聚蛋白，衣壳体（Ｐ１）的释放在肠道病毒中是由２Ａ邋（黑色箭头）切割的，在口蹄疫病毒中是通过ＮＰＧｏｔｉｆ邋（白色箭头）完成的。Ｐ２和Ｐ３多肽是基因组复制所必需的非结构蛋白前体。进一步白剪切是由３Ｃ来进行的。ＬＰ？通过自剪切从Ｐ１中释放出来。ＶＰ０是ＶＰ４和ＶＰ２的前体，是自催化的。底部的编码指的是卩NB１（NB０１１４９）和卩１＾0￥0６（八丫５９３８２９）的基因组［８，９］。逡逑邋２Ｃ蛋白的研究现状逡逑．１邋２Ｃ蛋白简介逡逑非结构蛋白２Ｃ是微小ＲＮＡ病毒研宄领域中最受关注的蛋白之一，它在ＮＡ病毒当中高度保守。２Ｃ通常由？３３０个氨基酸组成，遗传学研究已经确２Ｃ的许多功能，包括脱衣壳［１０］、宿主膜重排［１１，邋１２］、病毒ＲＮＡ结合［１３］、ＮＡ复制［１４］和衣壳化［１５，邋１６］等。该蛋白被显示为低聚物［１７，邋１８］，并与衣壳Ｐ３和非结构蛋白２Ｂ和２ＢＣ、３Ａ和３ＡＢ和３Ｃ相互作用。逡逑一

学科学院＆北京协和医学院逦硕士学位白的１７－３４区段也可以形成一个两亲性ａ－螺旋，该结构参与了邋２Ｃ蛋膜融合过程，从而介导细胞膜的重排和基因组复制复合物的形成［１端３３个氨基酸的ＦＭＤＶ邋２Ｃ蛋白可以获得可溶性表达，并且该蛋活性和ＲＮＡ结合能力，同时在底物ＡＴＰ和ＲＮＡ存在的情况下，在到六聚体［２１］。逡逑蛋白的Ｎ端结构域之后有一个标准的ＡＴＰａｓｅ结构域，包含了典型的ＸＸＧＫ（Ｔ／Ｓ）模序、Ｗａｌｋｅｒ邋Ｂ邋（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＧＸＸＸＸＬｈｈｈｈＤ邋模序和邋ＳＦ３Ｍｏｔｉｆ邋Ｃ邋（Ｎ２２３）模序［２２］。１９９３年Ｐｅｄｒｏ在研究ＰＶ邋２Ｃ蛋白时证明ａｓｅ活性［２３］。２０１５年周溪首次发现了邋ＥＶ７１邋２Ｃ具有ＡＴＰ依赖的３’－５’不依赖ＡＴＰ底物的分子伴侣功能，它可以在没有ＡＴＰ的情况下双链，并且能够帮助ＲＮＡ退火形成新的ＲＮＡ构象［２４］。逡逑

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本文编号：2770936