老年人骨髓多能性干细胞的培养、分析及其向多巴胺能神经元的定向分化研究

发布时间：2020-07-26 17:19

【摘要】：前言干细胞指的是同时具有自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞，干细胞从来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)和不同组织来源的成体干细胞(adultstem cells, ASC)。其中ESC来自于囊胚的内细胞团,先后从小鼠、灵长目动物及人中分离得到。ESC具有近乎无限的自我更新和分化能力，可以产生三个胚层方向的终末分化细胞，进而形成各种器官包括中、内和外胚层器官。ASC研究最早最深入的是造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)。之后又陆续报道了神经干细胞(neural stemcells, NSC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells)、以及其他来源的干细胞种类，如肠干细胞，表皮干细胞，肝干细胞（也称卵圆细胞）等。在组织生长与再生过程中，干细胞会不断的改变其性状：在胚胎发育期，干细胞快速分裂实现迅速生长；到青春期后，个体生长变慢或停止，而大部分干细胞也进入休眠，仅为维持组织自稳态而产生分裂增殖；到老年后，干细胞表达更多的抑癌性的管家基因，从而降低癌症发生率，但同时也降低了再生能力，即细胞发生衰老，干细胞内部的这些改变一般通过常染色体基因的变化来体现。目前已知的衰老机制为，组成细胞的各种理化物质在机体运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤，造成功能退行性下降。细胞衰老是细胞在经历了增殖、分化过程后，不可避免出现的，各细胞器在内外环境的损伤因素下，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老，是机体发育过程中的一种正常生命现象。其特征包括：细胞内酶的活性降低；色素积累；细胞内呼吸速度减慢，胞核增大，核膜内折，染色质收缩，颜色加深。线粒体数量减少，体积增大；胞膜通透性功能改变，使物质运输功能降低等。分子水平的变化主要有DNA的复制与转录出现抑制，RNA含量降低，蛋白翻译和合成减少，以及细胞膜内不饱和脂肪酸等的氧化现象等。在衰老形成各种原因中，年龄与衰老无疑具有最大的相关性，并可引起与细胞衰老相关的多种疾病，如阿尔兹海默（老年性痴呆）、帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)、关节退行性改变等等各种疾病。 PD是一种神经退行性疾病，在55岁以上人群中发病率高达1%以上，在中外流行病学分析中都有报道。已知帕金森的发病是由于中脑黑质中多巴胺能神经元受损引起，导致神经递质多巴胺(Dopamine, DA)的减少，从而引起相关神经传导异常，而导致一系列的神经系统症状，包括静止性震颤，自主运动等。目前PD的常规治疗方法仍然是药物疗法，常用左旋多巴等药物以替代多巴胺，但会导致一系列的副作用。与此同时，PD作为一种由单一细胞种类损坏引起的疾病，干细胞治疗是非常值得期待的疗法。目前认为可能用于PD治疗的干细胞来源包括ESC，NSC，诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, IPS)，MSC等。ESC体外向DA神经元分化已有报道。但是胚胎干细胞一般是来自于异源性组织的细胞，有免疫排斥的风险。近来有成体细胞核移植获得的ESC，即SCNT-ES，可避免免疫排斥反应，但在体内有成畸胎瘤的可能，且ESC的伦理学争议较多。NSC，一般来自于胚脑神经组织，体外也可分化为脑组织中几乎所有类型的神经元，包括DA神经元。但是NSC分化潜能比ESC较弱，定向分化效率也较低，同时来源有限，且有伦理学争议。IPS的发现，使干细胞的理念进一步更新，IPS具有与胚胎干细胞相类似的全能性，且细胞可来自于自体，体外分化为DA神经元也有报道，但IPS需要导入基因，安全性仍未明确。所以目前仍然以自体来源的尤其是骨髓来源的干细胞最为方便及安全。但是对于PD老年人群，自体骨髓干细胞是否存在，效果如何，仍未可知。本课题设计了老年人来源的骨髓多能祖细胞（clonal older-derived multipotentprogenitor cells, coMAPC）的分离培养实验，寻求合适的培养体系，以验证成体来源的骨髓干细胞的多能性及干细胞特征。通过克隆化培养，获得单个干细胞来源的coMAPC细胞系，使coMAPC细胞更为纯化。coMAPC细胞表达多种干细胞多能性标记物Oct4，Sox2，Nanog，克隆化培养也使coMAPC保持更好的分化多能性和自我更新性。全基因组芯片分析证实coMAPC表达更低的衰老基因，证实了老年人骨髓中依然存在多能性依然保持较好的干细胞。采用特异性的二步法定向诱导coMAPC，即RA+bFGF诱导7天和Shh+neuralbasal诱导14天后，可定向诱导coMAPC分化为具有DA神经元样特征的细胞，并可分泌产生DA神经递质的功能性细胞。 Part：老年骨髓多能干细胞多能性干细胞的分离培养及鉴定方法：(1) coMAPC细胞的原代分离和培养：骨髓组织来源于临床志愿者捐献，采集年龄主要位于50-70岁区间，coMAPC培养基：基础培养基含59%DMEM，39%MCDB，1×ITS，1×HSA，1×LA，10-9M Dex，2%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的培养液，添加剂包括10ng/mL EGF，10ng/mLPDGF-BB。分离方法包括淋巴细胞分离液密度梯度离心法和全骨髓贴壁法两种，之后极限稀释后进行单克隆化培养获得coMAPC细胞：（2）coMAPC细胞的生长动力学测定：细胞计数情况绘制生长曲线；并计算得出细胞倍增时间，对细胞生长动力学进行全面整体评估。（3）细胞染色体标本的制备以及染色体数目分析：秋水仙素处理增殖期细胞，观察记录分散良好的分裂相。（4）免疫荧光细胞化学检测不同传代次数的coMAPC细胞分子表达。FCM检测不同传代次数后的coMAPC细胞，包括鉴定coMAPC细胞的表面分子标记物特征和细胞周期测定。（5）cMAPC的三胚层多向诱导分化：成脂、成软骨、成骨、成血管内皮、成肝细胞、成神经诱导后，分别用油红O染液、阿尔辛蓝染色、茜素红、CD31、vWF、Albumin和GFAP、Nestin、TAU、Tuj1等标记染色。（6）GFP标记的慢病毒Lentivirus感染标记coMAPC细胞：准备预先包装成功的缺陷病毒液，以及polybrene，按照相应浓度加入细胞培养液中。结果：（1）对不同年龄段人群来源的骨髓多能祖细胞进行了多种方法的分离培养，coMAPC细胞可从几乎所有年龄段的成体骨髓组织中分离获得。（2）表面标记物检测表明，coMAPC细胞表达CD29、CD44、CD90、CD105、CD106等，但不表达CD34、CD45等造血系统来源标记。同时人类白细胞抗原HLA-1经流式细胞检测也为阴性。流式细胞仪检测细胞周期也表明，在目前的培养方法和培养条件下，coMAPC的稳定增殖在前10次传代内基本保持稳定。细胞核型二倍体比例均为100%，同时细胞周期中处于静止期或增殖准备期（G0/G1期）的比例均在80%以上，凋亡细胞的比例为5%以下。上述结果表明coMAPC体外分离培养后可以获得较稳定的自我更新能力。（3）coMAPC表达一般中胚层来源的细胞骨架蛋白Vimentin，αSMA，coMAPC依然保留了中胚层来源的相关特征分子。而CD31、SSEA-1和MHC-I表达为阴性。在细胞生长曲线绘制中，可以看出coMAPC经历约3d左右的对数生长期后，进入增殖平台期。分时计数可算得coMAPC细胞倍增时间约为30h。（4）慢病毒感染coMAPC细胞同样具有较高感染效率，且对细胞生长状态未见明显影响。结论：coMAPC可从不同年龄段人群的骨髓中分离获得，且使用淋巴细胞分离液密度梯度离心法可更快更有效获得较为纯化的coMAPC细胞，现有培养体系和克隆化得到的coMAPC细胞，可以较为稳定的扩增，维持其自我更新能力。coMAPC表达Oct4、Sox2、Nanog等多能性基因，具有多向分化能力，coMAPC细胞的增殖曲线和细胞周期检测结果说明，对于长期传代培养以及骨髓标本来源较年长的体外培养细胞，其自我更新能力与稳定性不可避免会随着培养时间和传代次数增多而下降。慢病毒感染coMAPC细胞同样具有较高感染效率，且对细胞生长状态未见明显影响。 Part II：单克隆化的老年骨髓多能干细胞干性及特性分析方法：（1）coMAPC全基因组表达谱芯片分析比较。抽提coMAPC细胞的totalRNA。（2）total RNA为模板逆转录得到cDNA文库后，以cDNA为模板合成带有生物素biotin标记的antisense RNA(aRNA)。（3）aRNA进行片段化处理后，同Human GenomeU133Plus2.0Array芯片进行杂交。（4）使用Affymetrix公司的GeneChip2Scanner30007G扫描仪进行芯片扫描解读并与数据库中信息分析比较差异表达基因。（5）coMAPC细胞衰老基因的鉴定及比较：PCR法进行细胞周期调控分子p16, p19, p21, hTERT以及p53的mRNA检测，WB检测p16, p19, p21, hTERT以及p53的蛋白水平表达。（6）coMAPC克隆间多能性基因的表达比较，RNA水平比较基因为Oct4、Sox2、 Nanog、Oct4A、Oct4B。蛋白检测指标为Oct4、Sox2、 Nanog。结果：克隆化培养后，coMAPC细胞成为真正意义上的单个细胞来源的高纯度细胞群。cMAPC细胞的多能性基因Oct4、Sox2、Nanog等进行了RNA水平的比较分析。挑选出表达较高较稳定的D8株coMAPC细胞克隆进行扩增及后续检测。IF检测也证实D8可稳定表达多能性基因并位于细胞核内。对coMAPC细胞的全基因组芯片检测结果进行分析，并与数据库中MSC及ESC基因表达谱进行比较，证实coMAPC细胞周期相关基因存在差异化表达。PCR与WB检测结果表明p16，p19，P21和P53等衰老相关基因在coMAPC细胞内总体表达水平有所降低。而细胞增殖能力相关分子，hTERT的表达，在细胞总体水平有所升高。结论：总结这一部分实验，我们认为，coMAPC来源与自体骨髓，这种细胞在老年人骨髓中依然存在，而多能性分子的表达和三胚层方向多向诱导分化的阳性结果，提示老年人来源的coMAPC细胞，同样具有多能性分子的表达和稳定的自我更新能力。全基因组芯片检测比较coMAPC与MSC及ESC证实了coMAPC具有相对年轻化的基因表达特征，GO分析与Pathway分析提示细胞周期相关调节通路蛋白差异显著。p16，p19，P21和P53等衰老相关基因低表达表明克隆化培养方式可以筛选出具有年轻化性质的coMAPC细胞。coMAPC可以作为老年人细胞治疗的种子细胞。 PART III：老年骨髓多能干细胞(coMAPC)向多巴胺能神经元的定向分化方法：（1）二期诱导法诱导coMAPC细胞定向分化，第一期为coMAPC的神经外胚层诱导：取生长状态良好的细胞，消化获得单细胞悬液。细胞接种至FN处理后的6孔板爬片上，接种密度为3000个/cm2，基础培养基+bFGF（50ng/ml）+RA（10-8M）诱导7-10天。（2）第二阶段为多巴胺能神经元分阶段定向分化：弃掉一期诱导培养液，PBS清洗2次后，加入二期诱导培养液neuralbasal（购自Gibco公司）+SHH（RD250ng/ml）+Nurr1（RD200ng/ml）。每3天半量换液一次。维持14天。（3）免疫荧光检测coMAPC细胞定向分化过程中的神经标记物Tuj1，TH，En1，Ptx3，Nurr1，ALDH1A1，DAT，VMAT等（4）FCM检测TH与Tuj1双阳性比例，比较二期诱导法与已知诱导方法的分化效率。（5）coMAPC分化为多巴胺能神经元的功能鉴定。功能鉴定主要检测DA的分泌功能。使用酶联免疫反应吸附试验Elisa试剂盒完成。结果：对克隆化培养的老年多能成体祖细胞coMAPC细胞进行向多巴胺能神经元的定向诱导：在使用多种诱导因子和条件的情况下，通过分两步诱导的方法，成功的获得了具有多巴胺能神经元相关标记物且可产生特定物质TH的神经元样细胞。第一阶段，成功获得了类神经干细胞，可出现神经球样结构。分化后细胞可表达神经干细胞相关标记物，如Nestin，Mash1，Neurogenin1（Ngn1）等，神经元特异性标记物表达较弱，与此同时, Oct4开始出现表达减少，而神经系多能性标记物Sox2表达未见明显变化。第二阶段的诱导分化后，神经前体细胞转变为多巴胺能神经元样细胞。最终分化后细胞可表达多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶TH以及神经元特异性骨架蛋白Tuj1（βIII Tublin）。分化中细胞的En1、Ptx3、Nurr1、TH的RNA表达水平呈进行性变化，另外，蛋白水平检测相关特异性蛋白如TH、Nurr1以及Ptx3等，表达为阳性。功能相关性分子ALDH1A1、DAT、VMAT的表达呈阳性。而未诱导分化细胞未见表达。对二期诱导分化后进行流式细胞仪检测计数，其Tuj1和TH双阳性比例可达到70%左右。而后，分化的多巴胺能神经元进行功能学鉴定，采用ELISA法对诱导后细胞进行分泌DA的检测表明，未分化前，DA分泌检测为阴性，一期诱导分化后也未见DA分泌产生。在二期分化开始约1周后，可检测出DA的分泌，且DA分泌量呈进行性上升，而分化结束时DA分泌量趋于稳定。表明分化后细胞具有分泌DA的功能。神经递质分泌遵循神经电位调控分泌原则的。进一步的实验检测表明，诱导分化后神经细胞的DA分泌是受钙离子控制其神经递质释放的。结论：第三部分实验中，我们设计了对coMAPC细胞的定向诱导分化的两步走实验方案，从而实现了coMAPC向多巴胺能神经元的定向分化。在分化过程中，coMAPC细胞分别体现了神经前体细胞、多巴胺能神经元的特征标记。在诱导分化后，Tuj1和TH双阳性细胞的比例可达到约70%，证明我们的二期诱导法具有在定向诱导分化为DA神经元时具有较高的效率。这些结果说明，coMAPC细胞，作为老年人自体骨髓来源的干细胞，同样具有向多巴胺能神经元定向分化的能力和高效率。所以，对于老年性疾病来说，coMAPC细胞可做为合适的种子细胞进行替代治疗研究或药物研发研究。后续的分化细胞治疗功能研究，还需要进一步的动物体内实验的证实。小结：骨髓多能干细胞是一类骨髓来源的保守细胞，从老年人来源的骨髓中可以获得具有多能性的coMAPC细胞，通过克隆化培养的方式，可以筛选出自我更新能力高、分化潜能好的干细胞，coMAPC比克隆化前表达更低的细胞衰老相关基因，证明coMAPC具有相当年轻化的特征，可能是早期发育中保存较好的原始干细胞，可作为老年人细胞治疗的种子细胞来源。采用特殊的二期诱导分化方法，可诱导该类细胞向多巴胺能神经元方向定向分化，从而可以为帕金森病的临床细胞治疗提供合适的种子细胞。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【图文】：

体系,原代培养,人群,增殖时间

图 1-1. coMAPC 的培养及不同培养体系对比(1. MAPC 体系, 2. MSC 体系, 体系)A.培养 3d 后(10×10)，图上红色箭头所指处即为三角样或小梭形 coMAP圆圈内为散在红细胞或白细胞；B.培养 5d 后(10×10)；C. 原代培养达到度后(10×10)。D. coMAPC 稳定传代后形态均一(20×10)；E. 出现漩涡样(4×10)；F. coMAPC 核质比大。Photos in Light. G. 不同培养体系下老年骨细胞原代增殖时间。(均数比较用 T test, p <0.05)。2. coMAPC 细胞的克隆化培养克隆化培养过程: 另取 10 份 55 岁以下标本，把骨髓标本按 55 岁以下和（含 55 岁）人群来源的进行分组，共 2 组，原代分离培养使用淋巴细胞度梯度离心法进行。在稳定传代后，于 P3 代细胞开始进行极限稀释法克，接种密度为 0-1 个，在两组人群中，观察接种后单细胞生长情况，可见接种后，每个孔板约有 5-10 个左右接种数量过多或未见细胞贴壁。其余培有为数不多的单细胞开始生长，克隆化初期，细胞生长速度较慢，约 3-5 天细胞开始出现明显增殖，其后增殖类似于原代培养。细胞形态学表现与原

克隆形成率,来源

士学位论文率的比较:克隆形成后，继续扩大培养，并进行鉴定。在数达到 20 次后，即为成功克隆化的单细胞来源 coMA本接种 96 孔后的克隆形成率。统计两组来源不同的标除一份 55 岁以下标本因污染而培养失败外，55 以下人%）高于 55 岁以上人群（平均值 3.23%）图 1-2G&H。以上人群中，依然可以获得增殖力稳定的单细胞来源 coMAPC 是来自于成体组织内储存的胚胎期干细胞支持依据。同时，不同年龄段来源骨髓 coMAPC 克隆形我们，coMAPC 细胞的克隆化培养成功率与供体年龄具

多能性,基因表达,表面标记物

图 1-3.coMAPC 细胞克隆化培养前后多能性基因表达克隆化培养后，coMAPC 表达 Oct4、Sox2、Nanog，分别由 TRITRITC 标记为红色、绿色和红色 10×10；B．未克隆化的 MAPC 混多能性分子检测。DAPI 衬染呈蓝色。(放大倍数 20×10)coMAPC 细胞的分子标记表达及流式检测得稳定增殖的 coMAPC 细胞后，我们用免疫荧光细胞法检测对不法分离培养的 coMAPC 细胞中的常规分子 Vimentin、CD31、 αSMA 表达情况均进行了检测。图 1-4. A-B，可见 Vimentin、S。CD31 为血管内皮样细胞标记物，SSEA-1 为 ESC 早期标记物织相容性抗原，在我们对 coMAPC 细胞的检测中，这三种蛋白均未. C-E。地，我们对不同来源人群的 coMAPC 细胞进行流式检测表面标记同人群得到的 coMAPC 细胞中表现一致；而对于不同分离方法，法或全骨髓贴壁培养法分别得到的 coMAPC 细胞，其表面标记物图 1-4F 所示流式细胞仪进行表面标记物检测为第 P8 代 coMAPC

【共引文献】