人副流感病毒3型核心蛋白与磷酸蛋白相互作用对病毒复制和包涵体形成的影响

发布时间：2020-07-26 18:18

【摘要】：人副流感病毒3型(Human Parainfluenza Virus Type3, HPIV3)是引起婴幼几急性下呼吸道疾病如支气管炎、肺炎等的主要病原之一。它与人们所熟知的呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、麻疹病毒等一样,都属于不分节负链RNA病毒。目前,对于HPIV3还没有有效的抗病毒药物和疫苗。因此,澄清HPIV3的复制转录的机制将为下一步研制有效的抗病毒药物和疫苗提供理论和实验基础。病毒的核心蛋白(Nucleoprotein, N)包裹病毒的基因组形成N-RNA模板,磷酸蛋白(Phosphoprotein, P)则是病毒RNA聚合酶辅因子。它们与聚合酶的大蛋白(Large protein, L)起组成病毒RNA聚合酶复合体,在病毒转录复制过程中起着非常重要的作用,也因此N蛋白和P蛋白之间的相互作用一直是HPIV3的复制转录机制研究的热点。而之前的研究表明,N蛋白氨基端的氨基酸是它完成自身寡聚化以及与RNA结合形成N-RNA模板的关键区域,而它的羧基端则是N-RNA模板与P蛋白结合的关键区域。通过对P蛋白的序列及结构分析,它与N。形式的N蛋白相互作用的区域位于P蛋白氨基端的40个氨基酸内,与N-RNA相互作用的区域位于其羧基端的20个氨基酸内。尽管近几年对N蛋白与P蛋白相互作用的研究已经很多了,也得到了很多与复制转录机制有关的研究结果,但关于它们之间的相互作用仍有很多问题有待进一步的研究和确认,例如N蛋白上和P蛋白的相互作用的具体位点,N0与P蛋白、N-RNA与P蛋白相互作用的联系和区别等。为了寻找N蛋白上调节N蛋白和P蛋白的相互作用的具体何点,并进一步弄清楚N蛋白与P蛋白相互作用的具体机制,我们利用HPIV3的微基因组系统,发现了N蛋白上的一个关键氨基酸Leu478,这个氨基酸位点的丙氨酸扫描突变体(NL478A)丧失了RNA合成的能力,并通过免疫共沉淀的方法,证明了这个位点的氨基酸突变丧失了与P蛋白相互作用的能力。为了进一步的区分N0与P蛋白、N-RNA与P蛋白相互作用的差异,我们利用经CsCl密度梯度离心纯化的N-RNA与P蛋白及其突变体在体外进行免疫共沉淀实验,发现这个位点的氨基酸突变体只是丧失了N-RNA与P蛋白的相互作用的能力,对于N0-P的相互作用则没有影响。同时,我们检测它们在细胞内的定位情况,发现野生型N蛋白与P蛋白可以形成病毒转录和复制的中心---包涵体,而N蛋白突变体则不能。随后,我们将这个突变引入到病毒基因组中利用反向遗传学构建重组病毒,但经过多次重复均不能得到带有NL478A突变的重组病毒。通过野生型N蛋白与P蛋白突变体共定位的研究,发现N0以及N-RNA与P蛋白的相互作用对于包涵体形成都是必不可少的。而且通过P蛋白氨基端缺失突变体与羧基端缺失突变体在包涵体及RNA合成方面的互补研究发现P蛋白是一个多功能的蛋白,它存在多个不同的结构域调控N蛋白和P蛋白的相互作用,并调节包涵体的形成。我们的研究首次对副粘RNA病毒N蛋白和P蛋白的相互作用的位点以及包涵体形成区域进行了精确定位,为抗病毒研究药物和疫苗的研发提供了新的理论和实验依据,对其它负链RNA病毒N蛋白和P蛋白功能研究也具有一定的启示意义。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.13
【图文】：

模式图,病毒粒子,模式图,倍数

图1.丨HPIV3病毒粒子的电镜照片及模式图(Bukreyev，Marzi et al. 2009, Moscona 2005)。2 HPIV3的生物学特性2.1 HPIV3的基因结构HPIV3的基因组是由一条被N蛋白所包裹的单股负义、不分节的RNA成的。它含有15462个核苷酸，在数量上正好是6的倍数，HPIV3的基因组遵循负链RNA病毒普遍存在的“6的倍数”的原则(Calain and Roux 1993)。2

示意图,基因结构,示意图

图1.2HPIV3基因结构示意图。如图1.2所示，在HPIV3基因组的两端各有一段在病毒转录和复制过程起到类似于启动子作用的序列：位于3’由55 nt组成的前导序列（Leader, Le)和位于5’端由44 nt组成的拖尾序列（Trailer, Tr)。在这两段序列之间，HPIV3的各基因的编码序列依次排列，每两个基因之间通过一个基因间隔区域（Genie Junction，GJ)分开。这个基因间隔区域则由三个部分组成：基因起始序列（Gene start，GS),基因间隔序列（Gene interval, GI)和基因结束序列（Gene end，GE) (Durbin, Siewetal. 1997, Mao, Thakuretal. 2008)。在GS中存在一些比较保守的基因序列，具体表现为3’-UCCUnnUUUC-5’，其中nn表示此处的基因序列可以是任意的不保守核节^酸序列。这样的一段保守的基因序列可能与聚合酶的识别及进入有关，也可能与病毒 mRNA 的加帽有关(Hinzman, Barr et al. 2002)。在病毒进行转录的时候，从基因组的3’^u始在病毒自身RNA聚合酶…L蛋白的作用下经过一系列的启动-停止的方式先合成52nt的前导序列（Leader，Le),

复制过程,病毒

内的部分发生相互作用，参与病毒的组装和出芽过程。4) F蛋白：通过自身结构的改变，介导病毒对细胞的入侵。5)HN蛋白：可以与细胞表面的唾液酸受体结合，介导病毒的吸附，同时还具有神经氨酸酶活性参与病毒的释放过程，此外它还具有激活F蛋白的能力(Lawrence, Borg et al. 2004)。6) L蛋A:病毒聚合酶的主要组成部分，也是RNP的重要组成成分之一。7) C、D 和 V:参与病毒与细胞的互作(Malur, Chattopadhyay et al. 2005)，对转录复制也起到一定的调节作用(Durbin, McAuliffe et al. 1999)。其中C蛋内就被报道可以与病毒的L蛋A相结合，抑制病毒的复制过程(Mao, Chattopadhyay et al.2009)。2.3 HPIV3的生活史HPIV3感染细胞后在宿主细胞的细胞质中完成0身的复制和扩增，具体过程如图1.3所示。

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