IL-35在DSS诱导IBD小鼠模型中的表达和分子机制的研究

发布时间：2020-07-26 20:48

【摘要】：在成功建立DSS诱导IBD小鼠模型,研究IL-35对于肠道免疫耐受的影响,并进一步探讨其机制。第一部分初步分析DSS诱导IBD小鼠模型中IL-35的表达和意义目的:初步分析DSS诱导IBD小鼠模型中IL-35的表达和意义材料与方法:本课题采用Balb/c雌性小鼠5-6周龄,体重15-20g,将小鼠随机分为实验组20只(口服4%DSS),对照组10只(口服蒸馏水),实验过程中每天记录小鼠体重、皮毛、精神状态及排便情况,7d后处死小鼠,收集血清用酶联免疫吸附试验(ELISA),检测血清中IL-35的表达水平;分离肠道组织使用qRT-PCR和免疫组化、Western Blot对肠粘膜组织中的表达进行分析,结果采用统计学分析。结果:血清IL-35的表达:IBD小鼠模型中血清IL-35的表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义;肠道黏膜IL-35的表达:qRT-PCR检测实验组中EBi3和IL-12a表达水平高于对照组,差异有统计学意义,免疫组化提示IL-12a、STAT1肠道组织中高表达,做表达于肠道间质,Western Blot结果显示IL-12a,STAT1模型组表达高于对照组,差异有统计学意义。结论:IL-35在IBD小鼠模型血清中含量下降,在病变肠道组中表达升高,IL-35可能作为保护性因子,在IBD发病过程中起到一定作用,可能会成为IBD新的检测和治疗靶点。同时研究发现IL-35可能通过STAT1的信号通路参与IBD发病。本实验研究较为局限,仍需进一步结合临床病例,分子生物学实验完善IL-35的分子机制。第二部分SHIP1对巨噬细胞系的增殖和凋亡的影响目的:通过调控miR-155与SHIP1的表达,分析SHIP1对RAW264.7和BMDM细胞系的增殖和凋亡,探讨SHIP1在巨噬细胞增殖中的作用。材料与方法:1、首先通过靶标分析软件数据库miRBase,PicTar和miRanda,结合文献报道筛选出SHIP1基因突变相关miR-155的作用靶点;2、其次构建用靶点双荧光素酶报告载体,与miR-155mimics及miR-155inhibitor共转染在RAW264.7和BMDM中,观察miR-155是否能够与靶基因3'-UTR区中预测的位点结合;3、实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western-blot(WB)检测miR-155对SHIP1 mRNA和蛋白的表达的影响4、通过MTT实验观察调控miR-155和SHIP1蛋白的表达对细胞系增殖的影响,5、通过ELISA检测转染后RAW264.7和BMDM中炎性因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ的表达情况。结果:1、利用生物软件预测到miR-155靶基因位点。2、通过构建含有miR-155靶基因位点的双荧光素酶报告载体,证实了miR-155能与SHIP1上靶基因位点结合,并且可以抑制SHIP1mRNA和蛋白的表达。3、MTT实验分析发现过表达miR-155促进细胞增殖,上调SHIP1蛋白表达抑制细胞增殖,比较有统计学意义(p0.05)4、ELISA分析过表达miR-155诱导IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ,上调SHIP1 表达可以抑制IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-y过表达(p0.05)结论:调控SHIP1的表达可以缓解miR-155对于巨噬细胞活化及源性炎性因子表达的影响。第三部分IL-35对IBD小鼠模型巨噬细胞极化的影响目的:初步分析IL-35对IBD小鼠模型中巨噬细胞极化的影响及机制初步研究材料与方法:用Balb/c雌性小鼠5-6周龄,体重15-20g共30只,设立对照组、模型组(口服4%DSS 7d)、IL-35干预组(口服4%DSS 7d,第2d至第5d,腹腔注射2ug/只),每组10只。7d后处死小鼠,留取血清和肠道组织,进行HE染色观察各组结肠组织病理形态变化;流式细胞技术检测各组M2型巨噬细胞的数量变化;免疫组化检测各组肠道组织SHIP1的表达;RT-PCR检测各组肠道组织中SHIPlmRNA的变化和Western-blot检测各组肠道组织中SHIP1蛋白的表达情况。同时检测对照组、模型组、IL-35干预组中巨噬细胞极化因子的表达情况。结果:对照组、DSS模型组、IL-35干预组模型构建成功;IL-35干预组结肠炎较对照组和模型组损伤程度减轻;IL-35干预组较模型组M2型巨噬细胞数量增加,提高M2/M1比值;IL-35干预组较模型组SHIP1蛋白的表达增加。IL-35干预组较模型组M2型极化相关因子的表达增加。结论:IL-35能缓解DSS诱导的IBD小鼠模型,可能通过调控SHIP的表达,促进M2巨型细胞极化有关。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574;R-332
【图文】：

示意图,炎症性肠病,发病机制,示意图

的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包溃疡性结肠炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）逡逑和克罗恩病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ邋ｄｉｓｅａｓｅ，邋ＣＤ），发病机制目前还不清楚［１］。ＩＢＤ主要包括逡逑溃v 性结肠炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）和克罗恩病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ邋ｄｉｓｅａｓｅ，邋ＣＤ），逡逑具有反复发作的特点，严重可导致肠道梗阻、穿孔。流行病学分析发现北美地区逡逑ＵＣ的患病率为３７．邋５－２３８／１０万人，ＣＤ的患病率为４－２０１／１０万人，而每年的新发病例逡逑分别为２－１５／１０万人和４－１０／１０万人［１］。我国１９９３年６月在全国慢性非感染性肠道逡逑疾病学术研究会，提出了ＵＣ和ＣＤ较为详细的诊断标准和疗效判断标准，并在２００７逡逑年和２０１２年分别提出ＩＢＤ的规范诊治建议［２］．近年来我国ＩＢＤ的发病率迅速增加；逡逑过去十年中，ＩＢＤ病例数增加约２．邋５倍；其中ＣＤ患者增加了邋１５．邋７倍［３］。逡逑

辅助性,亚群,细胞,细胞因子

图２辅助性ＣＤ４＋Ｔ细胞（ｈｅｌｐ邋Ｔｃｅｌｌ，邋Ｔｈ）亚群。根据Ｔｈ功能和分泌的细胞因子不同，可分逡逑为Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ细胞亚群，分泌特征性炎性因子逡逑ＩＬ－３５是２００７年由ＶｉｇｎａｌｉＤＡ等发现并命名的新型细胞因子，ＩＬ－３５是逡逑ＩＬ－１２家族的最新成员，由ＥＢＩ３（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｇｅｎｅ邋３）及Ｐ３５亚基组成的逡逑异源性二聚体［９］。在第１３届免疫学国际会议上首次命名为ＩＬ－３５，但与其他的ＩＬ－１２逡逑家族成员不同的是，ＩＬ－３５主要由ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ，逡逑Ｔｒｅｇ）产生细胞因子，被认为一种产生于Ｔｒｅｇｓ且为Ｔｒｅｇｓ发挥最大抑制功能所依逡逑赖的新细胞因子，抑制Ｔ细胞的功能，导致免疫耐受的形成。研宄发现ＥＢＩ３，作逡逑

免疫耐受,诱导免疫耐受,移植排斥反应,自身免疫病

？？．逡逑逦南京医科大学博士学位论文逡逑（如ＨＣＶ）、自身免疫病和移植排斥反应的靶点。目前最新一项临床研宄证实：ＩＢＤ逡逑患者ＩＬ－３５表达增加与ＩＢＤ炎症反应下调具有相关性［１１＇１２］邋，邋ＩＬ－３５可能会成为治逡逑疗ＩＢＤ的重要分子靶点之一［１３１，邋ＩＬ－３５是否可有诱导免疫耐受，缓解ＩＢＤ免疫紊乱逡逑目前还不清楚。逡逑ＩＬ－３５

【参考文献】