miR-150调控NKT细胞在细菌感染和自身免疫病中作用

发布时间：2020-07-28 22:57

【摘要】：目的探讨miR-150敲除通过NKT细胞对细菌感染和类风湿关节炎疾病的影响。方法1采用流式细胞仪分选小鼠胸腺不同发育阶段NKT细胞,提取细胞总RNA,经反转录和预扩增后利用TaqMan低密度microRNA表达谱分析检测NKT发育、成熟过程中特异microRNAs表达变化,并采用real-time PCR进一步验证。2采用miR-150基因敲除小鼠(miR-150 KO),以C57BL/6J小鼠作为对照小鼠(WT),制备大肠杆菌感染模型。通过比较细菌感染小鼠的存活率和小鼠肝脏、肺脏细菌数探讨miR-150敲除对小鼠抗感染能力的影响。采用流式细胞术和外周血瑞氏染色检测大肠杆菌感染miR-150 KO和WT小鼠的NKT细胞和中性粒细胞数量变化;3采用鸡II型胶原和弗氏完全佐剂建立miR-150 KO小鼠和WT小鼠的类风湿关节炎模型,对小鼠后肢进行测量和病理评分,评估mi R-150敲除对小鼠类风湿关节炎发病进程和严重程度的影响;采用流式细胞术检测miR-150敲除对类风湿关节炎小鼠NKT细胞、CD4~+T、CD8~+T细胞和B细胞数量的影响;采用细胞内染色检测mi R-150敲除对类风湿关节炎小鼠NKT细胞IFN-γ、IL-4和IL-17表达的影响;采用real-time PCR检测mi R-150敲除对类风湿关节炎小鼠关节腔滑膜液细胞TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-17 mRNA表达的影响。结果1 NKT细胞发育、成熟过程中,共有92个microRNAs表达发生显著变化。表达显著增加的microRNAs有71个,其中有36个表达持续增加;而表达显著降低的microRNAs有21个,其中有12个表达持续降低。选取Let-7f、miR-150、miR-155、miR-223、miR-24和miR-29进行real-time PCR,发现Let-7f、miR-150、mi R-24、miR-29在NKT细胞发育、成熟过程中表达增加,而miR-223和miR-155表达降低,其表达变化趋势与表达谱分析一致。2与WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠在细菌感染后的存活率明显高于C57BL/6J小鼠,且其肺脏细菌数明显少于C57BL/6J小鼠。与WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠NKT细胞在细菌感染前后没有明显变化,但miR-150 KO小鼠中性粒细胞在细菌感染前后均有显著增加。3 MiR-150 KO小鼠类风湿关节炎的发病率和病情严重程度明显低于WT小鼠;与WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠NKT细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和B细数量无明显变化,但miR-150 KO小鼠NKT细胞产生的IFN-γ和IL-4显著增加,而IL-17显著降低。与WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠关节腔滑膜液中细胞TNF-α和IL-4表达显著降低,IFN-γ和IL-17也呈表达降低趋势。结论1 NKT细胞发育、成熟过程中伴随大量特异microRNAs的不同表达变化,其中miR-150在NKT此病发育、成熟过程中表达显著增加。2 MiR-150敲除可显著增加小鼠的抗细菌感染能力,其机制可能主要与miR-150敲除导致的中性粒细胞增加有关,而与NKT细胞无明显关系。3 MiR-150敲除可抑制小鼠类风湿性关节炎的发生和发展,其机制可能与miR-150敲除NKT细胞产生IFN-γ和IL-4显著增加,而IL-17显著降低有关。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

NKT细胞,胸腺,分选,细胞

1.2 试验结果1.2.1 不同发育阶段 NKT 细胞的分选新鲜分离的小鼠胸腺细胞，首先经 Biotin 磁珠阴性选择除去 CD8+胸腺细胞以达到富集 NKT 细胞的目的，再经 anti-mouse-TCR-FITC antibody、α-GalCer/CD1dtetramer 染色，可得到 CD8+T 细胞剔除后胸腺 NKT 细胞比例（图 1）增加了 10倍以上；进一步采用 anti-mouse-NK1.1-APC antibody、anti-mouse-CD44-PE-Cy5antibody 染色，发现 C57BL/6J 小鼠胸腺中 NKT 细胞以成熟 stage 3（CD44+NK1.1+）为主，比例在 85%以上；非成熟 stage 1（CD44-NK1.1-）和 stage 2（CD44+NK1.1-）NKT 细胞的比例分别为 2%和 10%，表明 NKT 细胞发育正常（图 2）。经 FACSAria II 流式细胞仪分选得到的不同发育阶段的 NKT 细胞，纯度在 90%以上，可以用于后续 microRNA 表达谱的分析。

NKT细胞,胸腺,比例,表达谱

图 2 胸腺中不同发育阶段的 NKT 细胞比例e percentage of thymus NKT cells at different developmen成熟过程中 microRNA 表达谱的变化到的不同发育阶段的 NKT 细胞，提取总 RNA cDNA，并将其分别加入到 miRNA 分析阵列板程中 microRNA 表达谱的变化（图 3）。分析ge 1 到成熟的 stage 3 过程中，显著表达变化的 stage 1 相比，stage 3 中表达显著增加的 mic降低的 microRNAs 有 21 个（表 6）。

细胞发育,表达谱,成熟过程

图 2 胸腺中不同发育阶段的 NKT 细胞比例Fig.2 The percentage of thymus NKT cells at different developmental stages 细胞发育成熟过程中 microRNA 表达谱的变化ACS 分选得到的不同发育阶段的 NKT 细胞，提取总 RNA，经反转录得到对应的 cDNA，并将其分别加入到 miRNA 分析阵列板 A 和 B 中细胞发育过程中 microRNA 表达谱的变化（图 3）。分析结果显示，成熟的 stage 1 到成熟的 stage 3 过程中，显著表达变化的 microRN其中，与 stage 1 相比，stage 3 中表达显著增加的 microRNAs 有表达显著降低的 microRNAs 有 21 个（表 6）。

【参考文献】