两类胶原的提取及对小鼠类风湿关节炎的缓解作用

发布时间：2020-07-29 07:34

【摘要】：本论文主要研究内容是提取了I型胶原和II型胶原,分析了二者的性质,并研究了这两类胶原对类风湿关节炎的缓解作用。以猪蹄筋为原料,依次经浸泡、剪碎、脱脂,再经过乙酸浸提,盐析沉淀、透析,获得猪蹄筋酸溶性胶原(acid soluble collagen,ASC)。将提取ASC的残渣在乙酸条件下,利用胃蛋白酶酶解,依次经过盐析沉淀、透析,得到猪蹄筋酶溶性胶原(pepsin soluble collagen,PSC)。实验结果表明,猪蹄筋ASC和PSC的提取率分别是12.10%和17.39%(以干重计),二者的紫外光谱最大吸收波长分别为224 nm和209 nm;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳结果显示,二者均有两条α带(α_1和α_2);氨基酸分析显示,二者符合I型胶原的特性;傅里叶变换红外光谱显示,二者有相似的吸收峰均符合I型胶原特征吸收峰;圆二色光谱(CD)结果表明,二者变性温度分别为39℃和32℃。以上结果说明猪蹄筋ASC和PSC符合I型胶原性质,为典型的I型胶原。以鸡胸软骨为原料,经清洗、去骨膜、切碎、脱脂,酸性条件下加入胃蛋白酶酶解,盐析沉淀、透析,得到鸡胸软骨PSC。对样品进行紫外、红外、电泳、氨基酸分析、CD检测及肽质谱指纹图谱分析。结果表明,鸡胸软骨PSC的提取率是18.51%(以干重计),紫外最大吸收波长为217 nm;SDS-PAGE电泳图显示,胶原含有一条较粗的α带;氨基酸分析结果符合II型胶原的特性;圆二色光谱结果表明,其变性温度为38℃。以上结果表明,该方法提取得到的鸡胸软骨PSC符合II型胶原的性质,为II型胶原。建立类风湿关节炎动物模型。C57BL/6 J小鼠随机均分为7组:空白组、模型组、I型胶原组、I型胶原+Na_2SeO_3组、II型胶原组、II型胶原+Na_2SeO_3组、Na_2SeO_3组。致炎后,每3d称量并记录体重,每3d对小鼠右后足进行关节炎评分,于加强免疫后第35d全部处死、收集血清,测定血清中部分促炎症细胞因子、取右后足趾关节进行切片病理观察、取小鼠右后足踝关节进行扫描微CT、提取小鼠关节总RNA进行RT-PCR分析。实验结果表明,与空白组相比,模型组和I型胶原组小鼠的右后足部炎症状况处于加重趋势,而II型胶原组、II型胶原+Na_2SeO_3组炎症状况均有不同程度的减轻;其中,II型胶原+Na_2SeO_3组炎症缓解情况比较明显。与模型组相比,I型胶原组小鼠血清中的促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、IкB的含量无显著性差异(p0.05),而II型胶原+Na_2SeO_3组有显著改善(p0.05)。小鼠足踝关节扫描微CT结果显示,与模型组相比,I型胶原组踝关节的侵蚀并未减轻,而其他各组均有不同程度的减轻。提取小鼠右后足关节软骨总RNA进行RT-PCR分析,结果显示,与模型组相比,I型胶原组小鼠关节中的促炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α相对mRNA表达水平无显著性差异(p0.05),而II型胶原+Na_2SeO_3组的表达水平与模型组相比有显著性差异(p0.05)。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.22;R-33
【图文】：

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胶原电泳结果图

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证明动物模型构建成功。相较于模型组的炎症状况，随着每天的灌胃的持续进行直至采血处死前一天，如图3-6 所示，II 型胶原+ Na2SeO3组、II 型胶原组、Na2SeO3组右后足红肿症状均有所减轻，而 I 型胶原组小鼠的炎症情况并没有明显变化。3.3.2 小鼠体重变化分析按照 2.2.4.4 中的方法，观察小鼠生长状况并记录。结果如图 3-7 所示。试验过程中，初次免疫当天记为第 0 天，从第 1 天开始，每 3 天测量一次实验小鼠的体重，根据小鼠体重来确定每只小鼠灌胃剂量。整个实验过程中，空白组小鼠体重始终呈缓慢上升趋势；而其他各组小鼠体重先呈上升趋势，成功构建模型（第 21d 前后）后

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Fig. 3-7 Body weight change of mice：I 型胶原组；D：I 型胶原+ Na2SeO3组；E：Na2SeO3组；G：Na2SeO3组 group；C：CI group；D：CI + Na2SeO3group；E：group；G：Na2SeO3group析，对各组小鼠右后足趾进行关节炎评分。

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