弓形虫扁菱形蛋白酶4和组织蛋白酶C1的免疫学研究

发布时间：2020-07-29 15:46

【摘要】：背景刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,简称弓形虫)是一种专性细胞内寄生的原虫,可以引起人兽共患弓形虫病,其宿主范围广泛,包括大多数温血动物以及人类。在宿主免疫功能低下时(如艾滋病、长期应用免疫抑制剂者等),弓形虫感染可导致严重后果。而孕妇在怀孕期间发生原发性感染,可引起胎儿先天性弓形虫病,严重时可导致流产、畸胎或死产。弓形虫病还严重威胁着畜牧业的发展。弓形虫表达几种蛋白酶,其中包括丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶,它们在弓形虫感染宿主、生存和分化的过程中发挥着重要作用。扁菱形蛋白酶(Rhomboid proteases,ROM)属于丝氨酸蛋白酶家族。刚地弓形虫表达五种非线粒体扁菱形蛋白酶,即TgROM1-TgROM5。扁菱形蛋白酶在弓形虫入侵宿主时起着重要的作用。TgROM1在弓形虫的速殖子和缓殖子中均可表达;TgROM2和TgROM3主要表达于弓形虫子孢子期。TgROM4在速殖子和缓殖子中都表达,并且均匀分布在弓形虫表面;在弓形虫侵入宿主细胞时,TgROM4在调控微线体蛋白2(microneme protein 2,MIC2)、MIC3、MIC6 和顶端膜抗原 1(Apical membrane antigen 1,AMA1)中发挥着重要作用。TgROM5主要表达在弓形虫速殖子阶段,它参与了弓形虫MIC6、MIC12等的酶解。组织蛋白酶(cathepsin)属于半胱氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶在宿主-寄生虫的相互作用中发挥重要作用。弓形虫基因组编码5种组织蛋白酶,分别为组织蛋白酶 B(cathepsinB,TgCPB)、组织蛋白酶 L(cathepsinL,TgCPL)和 3 种组织蛋白酶C(TgCPC1,2和3)。组织蛋白酶C是弓形虫速殖子生长和分化所需的外肽酶。这些蛋白酶的抑制可导致弓形虫感染的明显减弱。TgCPC1和TgCPC2可表达在弓形虫速殖子中,主要位于致密颗粒和速殖子的纳虫空泡(parasitophorous vacuole,PV)中。PV在寄生虫侵入宿主细胞时形成。TgCPC1或TgCPC2至少其中之一是弓形虫侵入宿主细胞和生长所必需的,并且TgCPC1在弓形虫速殖子中高水平表达,但关于TgCPC1免疫原性的研究尚未见报道。而在弓形虫速殖子中未检测到 TgCPC3。速殖子(tachyzoite)、包囊(cyst)和卵囊(oocyst))是弓形虫生命周期中具有感染能力的主要阶段。目前治疗弓形虫速殖子引起的急性感染的药物有许多副作用,特别对胎儿;并且尚无有效药物治疗弓形虫包囊感染。所以安全有效的疫苗对弓形虫病的预防和控制至关重要。弓形虫疫苗的研究主要包括全虫疫苗、虫体特异组分疫苗和核酸疫苗。可诱导持久而强烈保护性免疫反应的DNA疫苗是一种有前途的选择。弓形虫上这些重要的参与弓形虫生命活动的蛋白是很好的DNA疫苗候选靶点。如研究表明弓形虫表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)是一种经典的优秀弓形虫DNA疫苗候选者;TgROM1的DNA疫苗、TgCPB的DNA疫苗和TgCPL的DNA疫苗对弓形虫的感染均具有一定的保护性。生物信息学是涉及多领域的交叉学科。它已被广泛用于分析蛋白质的结构和功能,及预测抗原表位。表位预测在弓形虫疫苗研究中发挥重要作用。尚未见关于TgROM4和TgCPC1的生物信息学分析的报道。影响疫苗免疫效果的因素有很多,免疫策略是决定免疫应答有效性的重要因素,并且在疫苗研究中越来越重要。初免-加强(prime-boost)免疫策略能够更有效地诱导体液和细胞免疫应答。佐剂可明显增强疫苗的免疫应答效果,经典佐剂有铝盐佐剂、弗氏佐剂等。α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)是一种有力的自然杀伤T细胞激动剂,可有效刺激自然杀伤T细胞;有研究表明,α-GalCer可增强某些疫苗的免疫效果。在本研究中,我们使用生物信息学的方法分析预测了弓形虫ROM4和CPC1蛋白的理化性质、结构和抗原表位,构建了基于这两种蛋白的抗弓形虫DNA疫苗,进行了动物实验来评估其免疫效果,并使用不同的方案来增强它们的免疫效应。目的应用生物信息学的方法分析预测弓形虫ROM4、CPC1蛋白的基本特性;预测它们潜在的T、B细胞抗原表位,为后续弓形虫DNA疫苗的构建提供理论依据。在此基础上,构建ROM4DNA疫苗,并使用初免-加强免疫策略进行动物实验来评估其免疫效果;构建CPC1 DNA疫苗,联合佐剂α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)进行免疫小鼠来评估免疫效果。本研究为弓形虫疫苗的靶点选择和免疫策略的优化奠定了一定的理论基础。方法1.生物信息学分析:(1)分别使用在线分析软件 ProtParam、NetPhos 2.0Server、CSS-Palm Online Service、TMHMM Serverv.2.0、PSORT Ⅱ Prediction 分析预测弓形虫 ROM4和CPC1蛋白的基本理化性质、磷酸化位点、酰基化位点、跨膜结构和亚细胞定位。(2)应用DNASTAR软件分析预测ROM4和CPC1蛋白的二级结构和潜在B细胞抗原表位。(3)使用在线分析软件IEDB预测ROM4和CPC1蛋白的潜在T细胞抗原表位。(4)将ROM4和CPC1蛋白的潜在抗原表位与弓形虫DNA疫苗经典候选蛋白SAG1的抗原表位相比较。2.载体构建与验证:(1)在对弓形虫ROM4和CPC1蛋白进行生物信息学分析的理论基础上,进行弓形虫DNA疫苗的构建。首先,通过PCR的方法分别获得TgROM4和TgCPC1的目的基因。(2)先后经过双酶切和连接,将TgROM4和TgCPC1基因分别与真核表达载体pEGFP-C1相连接,构建重组质粒pEGFP-ROM4(pROM4)和pEGFP-CPC1(pCPC1),并进行双酶切实验及测序来验证构建是否成功。(3)将构建成功的重组质粒pROM4和pCPC1转化到感受态细胞中进行大量提取,然后分别转染到HEK 293-T细胞中并提取蛋白,进行Western Blot实验,来验证重组质粒是否可以在真核细胞中成功表达目的蛋白。验证成功后,使用不同的方案免疫BALB/c小鼠来评估上述DNA疫苗的免疫效果。3.基于TgROM4的疫苗效果评估实验根据生物信息学分析结果选择ROM4蛋白上一段具有良好抗原性的多肽(YALLGALIPYCVEYWKSIPR)进行合成,并使用DNA疫苗初免-肽加强的方案进行免疫小鼠。将BALB/c小鼠随机分为5组,包括3个免疫组(肽免疫组,pROM4免疫组和pROM4/肽免疫组)和2个阴性对照组(PBS组和pEGFP-C1组)。然后将小鼠肌内免疫四次,其中pROM4/肽免疫组小鼠先后分别免疫pROM4和多肽各两次。免疫后,采用酶联免疫吸附测定法测定各组小鼠血清中IgG、IgG2a和IgG1水平;脾细胞培养后,检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的水平;用弓形虫RH株速殖子攻击小鼠并评估小鼠的存活时间。此外,用弓形虫PRU株包囊对小鼠进行灌胃后测定其脑内包囊的数量。4.基于TgCPC1的DNA疫苗效果评估实验将BALB/c小鼠随机分为5组,分别为2个免疫组(pCPC1组和pCPC1/α-GalCer 组)和 3 个对照组(PBS 组、pEGFP-C1 组和 α-GalCer 组)。将小鼠肌内免疫三次,其中pCPC1/α-GalCer组小鼠前两次免疫pCPC1,第三次同时免疫pCPC1和α-GalCer。免疫后,采用酶联免疫吸附测定法测定各组小鼠血清中IgG、IgG2a和IgG1水平;脾细胞培养后,检测细胞因子水平;用弓形虫RH株速殖子攻击小鼠并记录小鼠的存活时间。结果1.通过生物信息学软件分析预测,我们获得了弓形虫ROM4和CPC1蛋白的理化性质、磷酸化位点和酰基化位点、亚细胞定位、跨膜结构等基本信息,预测了这两种蛋白的二级结构;预测了它们的抗原表位,发现ROM4和CPC1蛋白与SAG1一样均具有多个潜在的优秀B细胞和T细胞抗原表位。这为后续实验提供了理论基础。2.在上述理论分析的基础上,通过PCR、酶切、连接等方法我们成功构建了DNA 疫苗,即 pEGFP-ROM4(pROM4)和 pEGFP-CPC1(pCPC1),并成功进行了验证。然后我们使用不同的策略免疫小鼠来评估其免疫效果。(1)基于TgROM4的疫苗效果评估实验结果用不同免疫方案接种的小鼠(肽免疫组,pROM4组和pROM4/肽免疫组)均引发了特异性体液和细胞免疫应答,产生了高水平的IgG、IgG2a、IL-2、IL-12和IFN-γ(与阴性对照组相比,P0.05),并且pROM4/肽免疫组的水平最高。而小鼠IgG1、IL-4和IL-10水平在五组间均无明显差别(P0.05)。用速殖子攻击后,实验组小鼠(肽免疫组,pROM4组和pROM4/肽免疫组)的生存时间均比阴性对照组明显延长,其中pROM4/肽免疫组小鼠生存时间最长。用包囊感染后,实验组小鼠脑包囊数目比阴性对照组明显减少,其中pROM4/肽免疫组小鼠脑包囊数目最少。(2)基于TgCPC1的DNA疫苗效果评估实验结果与阴性对照组(PBS组、pEGFP-C1组或α-GalCer组)相比,免疫组(pCPC1组和pCPC1/α-GalCer组)小鼠IgG、IgG2a、IL-2和IFN-y水平明显升高,并且pCPC1/α-GalCer组水平最高。α-GalCer组小鼠IL-4水平轻度升高,与PBS组相比pCPC1组IL-4水平无明显改变。小鼠IgG1和IL-10水平在五组间均无明显差异。用速殖子攻击后,免疫组小鼠的生存时间均比阴性对照组延长,其中pCPC1/α-GalCer组小鼠生存时间延长最多。结论我们首次通过生物信息学的方法对弓形虫ROM4蛋白和CPC1蛋白进行了分析预测,发现在理论上它们均具有良好的B细胞抗原和T细胞抗原,有成为弓形虫DNA疫苗的结构基础。通过动物实验表明,TgROM4和TgCPC1都是弓形虫DNA疫苗的优秀候选者。并且我们首次采用了 DNA疫苗初免-肽加强方案增强了 ROM4DNA疫苗的免疫效果,也首次采用佐剂α-GalCer增强了新的弓形虫DNA疫苗靶点CPC1的免疫效果。这说明DNA疫苗初免-肽加强免疫策略和应用佐剂都是提高弓形虫DNA疫苗免疫效应的有前途的方法。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

磷酸化位点,蛋白

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑图１：邋ＴｇＲ0Ｍ４蛋白中预测的磷酸化位点逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅｓ邋ｉｎ邋ＴｇＲＯＭ４邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑ＭｅｔＰｈｏｓ邋３．１ａ：邋ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ１邋ａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅｓ邋ｉｎ邋９ｉ邋２３２３５７０９邋ｄｂｊ邋ＢＤ１４逡逑１逦ｉ逦１逦１逦１逦１逦１逡逑

磷酸化位点,蛋白,酰基化,预测结果

图２：邋ＴｇＣＰＣＩ蛋白中预测的磷酸化位点逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅｓ邋ｉｎ邋ＴｇＣＰＣＩ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑３．２邋ＴｇＲＯＭ４和ＴｇＣＰＣＩ蛋白的酰基化位点预测结果逡逑

氨基酸,蛋白,亚细胞定位,预测结果

４．蛋白ＴｇＲ０Ｍ４和ＴｇＧＰＣＩ的跨膜结构和亚细胞定位预测逡逑４．１邋ＴｇＲＯＭ４和ＴｇＣＰＣＩ蛋白的跨膜结构预测结果逡逑分别如图３和图４所示。ＴｇＲＯＭ４蛋白上存在６个跨膜区，分别位于３４５－３６４逡逑位氨基酸、３６９－３９１位氨基酸、３９６￣４１８位氨基酸、４２５＊４４７位氨基酸、４５２４７４位逡逑氨基酸和５５６－５７８位氨基酸

【参考文献】