microRNA-155对BMSCs诱导免疫耐受能力的调节和机制研究
发布时间：2020-07-31 10:48
【摘要】：目的:探讨miR-155对骨髓来源间充质干细胞诱导免疫耐受能力的影响及相关免疫学机制。方法:实验分为Control组(不转染对照组)、miR-155 agomir NC组(高表达组对照组)、miR-155 agomir组(高表达组)、miR-155 antagomir NC组(抑制表达组对照组)、miR-155 antagomir组(抑制表达组)。第一部分:通过脂质体转染特异性调控miR-155表达水平,检测转染效率及转染后miR-155表达水平。第二部分:转染后的BMSCs在Transwell小室中诱导DCs 48小时,通过检测DCs表型变化及组间DCs迁移能力差异,比较不同miR-155表达水平的BMSCs对DCs成熟和迁移能力的影响,Western Blot检测诱导后DCs中AKT和NF-κB(P65)等信号通路蛋白表达情况,初步探索其影响机制。第三部分:在Transwell小室中,将诱导后的DCs与脾脏来源单个核细胞共培养72小时,流式细胞技术检测刺激后各组T细胞增殖能力和各T细胞亚群的比例变化;实时定量PCR检测IL-12a等细胞因子表达的组间差异,初步探索其影响机制。结果:第一部分:分离培养的BMSCs表面标志CD90、CD105、CD73和CD44阳性表达、CD31、CD45阴性表达。脂质体转染BMSCs的转染效率高,miR-155 agomir组的miR-155表达量升高了10000倍,miR-155 antagomir组表达量较其对照组明显下降(P=0.0014,P0.05)。第二部分:诱导DCs 48小时后,miR-155 agomir组DCs表面标志CD40和CD86表达量明显下降(P0.05),迁移能力较其对照组也明显下降(P=0.0054,P0.05),AKT和NF-κB(P65)信号通路蛋白表达量均明显下降(P0.01);miR-155 antagomir组DCs迁移能力增加(P=0.0114,P0.05),AKT和NF-κB(P65)信号通路蛋白表达量无明显变化(P0.05)。第三部分:刺激T细胞72小时后,miR-155 agomir组T细胞增殖能力较其对照组明显降低,Th1细胞亚群比例明显降低(P=0.0106,P0.05)、Treg细胞比例明显升高(P=0.0005,P0.05),T细胞中IL-12a相关的RNA表达量明显降低(P=0.0311,P0.05)。结论:MicroRNA-155可以提高BMSCs诱导免疫耐受的能力,即通过诱导DCs抑制T细胞增殖、抑制T细胞向Th1细胞分化从而诱导免疫耐受。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
3.1 BMSCs 形态学观察和表面分子鉴定3.1.1 BMSCs 细胞形态观察镜下观察获得的原代细胞大小不一，以圆形居多。在 37℃、5%CO2恒温培养箱中静置 72 小时后，镜下可见到骨片周围有多形性细胞爬出，数量不多，培养皿底部贴壁多为纺锤形细胞。培养约 1 周左右，皿底部可见细胞集落形成，且细胞增殖速度较前明显增加。培养约 2 周左右，可见大部分集落之间出现融合，细胞数目较多且排列规则，细胞融合度可达到 85%-90%左右时，按照 1:2 比例传代至 P1 代细胞。P1 代骨髓间充质干细胞生长明显变快，早期即可见到细胞贴壁且分布均匀，细胞形态较为规则，为长梭形。传代后 7 天左右细胞之间融合度即可达到 90%左右，镜下观察细胞不再形成集落，而是均匀生长在皿底部。再次传代至 P2 代时，去除皿中骨片。当细胞培养至 P5 代时，观察到细胞呈现典型的长梭形，也可多角形细胞，细胞形态大小分布等都比较均匀，如图 1-1 所示。取 P5 代 BMSCs 进行后续实验。
microRNA-155 对 BMSCs 诱导免疫耐受能力的调节和机制研究 第一部分CD105、CD73、CD44 的阳性表达率分别达到 90%、96%、95%和 99%，均为阳性表达，而 CD45 和 CD31 均为阴性表达。CD45 和 CD31 作为造血细胞的特异性表面标志物，在骨髓间充质干细胞中并不表达，而 CD90、CD105、CD73、CD44 则表达于骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ， 可 见 本 实 验 分 离 和 培 养 的 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 是CD90+CD105+CD73+CD44+CD31-CD45-的细胞，纯度较高。
BMSCs 诱导免疫耐受能力的调节和机制研究 倍（P＜0.0001），miR-155 antagomir 组 miR-155 表达水 组也明显下降（P=0.0114，P＜0.05）（图 1-5）。
本文编号：2776373
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
3.1 BMSCs 形态学观察和表面分子鉴定3.1.1 BMSCs 细胞形态观察镜下观察获得的原代细胞大小不一，以圆形居多。在 37℃、5%CO2恒温培养箱中静置 72 小时后，镜下可见到骨片周围有多形性细胞爬出，数量不多，培养皿底部贴壁多为纺锤形细胞。培养约 1 周左右，皿底部可见细胞集落形成，且细胞增殖速度较前明显增加。培养约 2 周左右，可见大部分集落之间出现融合，细胞数目较多且排列规则，细胞融合度可达到 85%-90%左右时，按照 1:2 比例传代至 P1 代细胞。P1 代骨髓间充质干细胞生长明显变快，早期即可见到细胞贴壁且分布均匀，细胞形态较为规则，为长梭形。传代后 7 天左右细胞之间融合度即可达到 90%左右，镜下观察细胞不再形成集落，而是均匀生长在皿底部。再次传代至 P2 代时，去除皿中骨片。当细胞培养至 P5 代时，观察到细胞呈现典型的长梭形，也可多角形细胞，细胞形态大小分布等都比较均匀，如图 1-1 所示。取 P5 代 BMSCs 进行后续实验。
microRNA-155 对 BMSCs 诱导免疫耐受能力的调节和机制研究 第一部分CD105、CD73、CD44 的阳性表达率分别达到 90%、96%、95%和 99%，均为阳性表达，而 CD45 和 CD31 均为阴性表达。CD45 和 CD31 作为造血细胞的特异性表面标志物，在骨髓间充质干细胞中并不表达，而 CD90、CD105、CD73、CD44 则表达于骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ， 可 见 本 实 验 分 离 和 培 养 的 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 是CD90+CD105+CD73+CD44+CD31-CD45-的细胞，纯度较高。
BMSCs 诱导免疫耐受能力的调节和机制研究 倍（P＜0.0001），miR-155 antagomir 组 miR-155 表达水 组也明显下降（P=0.0114，P＜0.05）（图 1-5）。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 Ying-Chun Meng;Zhen-Ying Ding;Hai-Quan Wang;Li-Ping Ning;Chao Wang;;Effect of microRNA-155 on angiogenesis after cerebral infarction of rats through AT1R/VEGFR2 pathway[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2015年10期
本文编号：2776373
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/2776373.html
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