人骨髓间充质干细胞体外培养及向感觉神经元诱导研究

发布时间：2020-08-02 09:08

【摘要】：第一章人骨髓间充质干细胞体外分离培养及鉴定 目的： 建立本实验室稳定分离扩增hBMSCs的方案并评估获取的细胞是否为hBMSCs,为后续实验奠定基础。 方法：采用直接贴壁法和密度梯度离心法同时分离hBMSCs,比较原代培养过程中集落出现时间、集落数目、P3代细胞生长曲线；利用流式细胞术检测P3代细胞表面抗原CD34、CD44、CD45的表达情况；成骨、成脂诱导液诱导所获得细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化,以茜素红及油红O染色法鉴定成骨分化中钙结节及成脂分化中脂滴的形成。 结果： 直接贴壁法和密度梯度离心法均能分离得到hBMSCs。直接贴壁法集落出现时间较密度梯度离心法短,集落数目多于密度梯度离心法,细胞增殖能力强于密度梯度离心法；流式细胞术检测直接贴壁法获得的P3代细胞CD34阳性率2.18%,CD44阳性率98.14%,CD45阳性率0.41%。成骨诱导后以茜素红染色可见钙结节,成脂诱导后油红O染色可见脂滴形成。 结论： 1、直接贴壁法和密度梯度离心法均能分离得到lhBMSCs; 2、综合比较集落出现时间、集落数目、细胞增殖能力,直接贴壁法优于密度梯度离心法； 3、经鉴定分离得到的为hBMSCs,为后续实验提供了稳定的细胞来源。 目的： 探讨人骨髓间充质干细胞向感觉神经元诱导的可能性。 方法： RT-PCR检测RA、Shh、Wnt信号通路相关RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、 Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在获得的hBMSCs中表达情况； 使用RA、Shh、Wnt1、RA+Shh、RA+Wnt1、Shh+Wntl、RA+Shh+Wntl共7组进行感觉神经元诱导,观察诱导后细胞形态改变,荧光定量PCR检测神经元相关基因β-tubulin3、MAP-2、Tau、GATA-3、Calretinin、Brn3a在各诱导组及hBMSCs中表达情况,免疫荧光检测诱导后感觉神经元相关标志GATA-3、Calretinin、Brn3a在各诱导组中表达情况,比较各组之间差异。 结果： RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、 β-catenin在hBMSCs中存在不同程度表达；各诱导组中均可获得神经元样细胞,免疫荧光显示RA+Shh组、RA+Shh+Wntl组中可见GATA3、Calretinin日性细胞,Wntl组、RA+Wntl组、Shh+Wntl组、RA+Shh+Wntl组中可Brn3a阳性细胞；荧光定量PCR结果示β-tubulin3、MAP-2、Tau在各诱导组中均较未诱导组表达上调,有显著性差异,各诱导组之间相对表达量无明显差别。GATA3在RA+Shh组、RA+Shh+Wntl组中较未诱导组增高倍数较大,分别为24.4倍、68.1倍,两组与未诱导组具有统计学差异,RA+Shh+Wntl组与RA+Shh组相比具有统计学差异。Calretinin在RA+Shh组、RA+Shh+Wntl组中较未诱导组增高倍数较大,分别为339.2倍、572.9倍,两组与未诱导组具有统计学差异,RA+Shh+Wntl组与RA+Shh组相比具有统计学差异。Brn3a在Wntl、RA+Wntl、Shh+Wntl、 RA+Shh+Wntl组较未诱导组均有显著性差异,分别增高143.0倍、94.2倍、132.3倍、424.3倍。 结论： 1、培养的hBMSCs中存在RA、Shh、Wnt作用基础； 2、Shh和RA单独诱导hBMSCs无法获得GATA3、CalretininP日性表达神经元样细胞,Shh和RA联合诱导hBMSCs可获得GATA3、Calretinin阳性表达神经元样细胞,但不能获得Brn3a阳性细胞。Wntl单独诱导hBMSCs可获得Brn3a阳性表达神经元样细胞。RA+Shh+Wntl组在各诱导组中具有最佳诱导效果,可获得GATA3、Calretinin、Brn3a阳性表达的感觉神经元样细胞。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【图文】：

集落开始出现。集落细胞形态以梭性为主，饱满折光性强，集落中央有杂质，细胞数目逐渐增多，集落变大（图1-C、D、E、F)，呈旋祸状生长，至第8天左右集落变大至相互汇合在一起，当汇合度约70%时，将P0传代至P1(图1-G、H、I、J)o传代后细胞分布均勾，生长速度较原代快，传代后30min,细胞即贴壁，此时细胞为圆形，至24小时后，细胞呈典型梭形（图1-G、H)，旋祸状生长

hBMSCs在加入成骨诱导液后，细胞形态逐渐发生变化，由长梭形变为多角形，诱导至21天时茜素红染色可见大量橘红色韩结节（图4-A、B)，说明培养的hBMSCs具有分化为成骨细胞能力，产生妈盐沉积。1.4.4成脂诱导hBMSCs在加入成脂诱导液后，细胞逐渐由长梭形变为圆形，胞体中出现空泡，诱导至9天时油红0染色可见大量红色脂滴（图4-C、D)，说明培养的hBMSCs具有分化为脂肪细胞的能力，产生脂滴。■ HA成骨诱导茜素红染色（40X) B成骨诱导茜素红染色（100X)PiW

本文编号：2778316