硫化氢促进不同缺血模型的血管新生及其机制研究

发布时间：2020-08-02 06:50

【摘要】：硫化氢(hydrogen sulfide, H_2S)是一种无色、有臭鸡蛋气味的气体。长时间以来,它被认定为是一种有毒的气体,大量吸入会导致中毒,其毒性作用主要通过抑制线粒体的细胞色素C氧化酶,影响呼吸链的活动,从而影响中枢神经系统和呼吸系统的活动。直到1989年,人们在大鼠和人脑中检测到了内源性H_2S,以及接下来发现的催化它产生的三种酶,说明H_2S可能具有一定的生理作用。越来越多的研究表明,H_2S在机体内的各个系统中都发挥着非常重要的作用。在神经系统中,H_2S既可以作为神经调节因子对神经系统的功能进行调控,也可以作为神经保护因子对神经系统发挥其保护效应。神经元中,它可以增强NMDA受体活性,易化长时程动作电位的产生,对记忆过程产生影响。在心血管系统中,H_2S通过开放血管平滑肌细胞上ATP敏感的钾通道(KATP通道),引起血管平滑肌细胞舒张,降低血压。在缺血再灌注模型中,它可以减小心梗面积,改善心梗后左心室功能。消化系统中,H_2S可以促进脂肪细胞和骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取,增加葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。鉴于H_2S对身体各个系统的重要的调节作用,还有它是一种小分子量的气体分子,能穿透细胞膜直接起效,在体内产生并受内源性关键酶的调节,生理浓度时有明确的功能并能被外源性气体模拟,H_2S成为继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第三个气体信号分子。血管新生是指在原有血管的基础上通过血管外基质降解,血管内皮细胞增殖、迁移形成子代血管支并具有血运功能的一个过程。它可发生于组织生长发育、创伤修复和肿瘤生长等多种生理、病理过程中。在血管新生方面,我课题组于2007年在国际上首次发现外源性H_2S具有显著的促血管新生作用。它不仅可以促进内皮细胞的增殖,迁移和管腔形成,还可以在小鼠Matrigel Plug动物模型上促进血管的新生。随后Szabo C等在鸡胚绒毛膜尿囊(CAM)模型中也证实了H_2S的促血管新生效应。缺血性疾病是一种临床上常见的高致残率、高致死率的疾病,它是由病理或者外界损伤导致机体动脉或者静脉血流急剧降低或中断,使得该血管的血供区失去氧气和营养物质的供给造成的。传统的缺血性疾病的治疗方法侧重于血管的再通,而忽略了血管再灌时对微循环的伤害,于是诞生了治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)。它是指将外源性血管新生诱导因子(如VEGF.bFGF)或其基因片段或干细胞转入缺血组织中,增强缺血区的侧支毛细血管新生,改善缺血区的血流,促进缺血区血供恢复。正常生理状态下,H_2S可以明显地促进血管新生,在疾病状态,如组织缺血时,H_2S是否也能促进血管新生,以及促进缺血组织血管新生的机制是什么,具有重要的研究价值。因此在本文中,我们将重点探讨H_2S在不同缺血模型中的促血管新生作用及其作用机制,为治疗性血管新生提供新的策略。首先,我们观察了外源性NaHS腹腔注射连续4 W对大鼠缺血下肢血管新生的影响。荧光微球法测血流结果显示,NaHS 20和50μmol/kg/day腹腔注射连续4 W,能够显著改善缺血下肢的血流供应；血管造影发现,NaHS 50和100 μmol/kg/day慢性给药组的侧枝血管形成最多；免疫组化结果表明各浓度的NaHS处理组能够不同程度地促进缺血下肢微血管的生成,以NaHS 50μmol/kg/day处理组效果最为显著；50μmol/kg/day的NaHS慢性给药组还能够显著提高增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)在两种细胞上的表达,促进内皮细胞和骨骼肌细胞的增殖；在缺血下肢中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)主要表达在骨骼肌细胞上,且不同剂量的NaHS腹腔注射连续4 W,能够不同程度地提高VEGF的表达；而VEGF受体2型(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)和phospho-VEGFR2主要表达在内皮细胞上,NaHS不改变VEGFR2的表达量,但是能够显著增强VEGFR2的磷酸化；而且NaHS也能够提高缺血组织中Akt的磷酸化水平。以上结果说明,NaHS确实能够促进大鼠缺血下肢的血管新生,改善缺血区的血供,该作用可能和促进缺血区骨骼肌细胞中VEGF的表达以及内皮细胞中VEGFR2的磷酸化有关。其次,我们成功建立了小鼠的心梗模型。并利用心电图(electrocardiogram, ECG)、心超、Evans' Blue-TTC染色和苏木精-伊红染色法(hematox ylin- eosin staining,HE染色)等技术,验证心梗模型是否成功。心梗手术后,小鼠心脏前壁变白,心跳减缓；ECG显示,ST段(J点)抬高,呈现缺血性变化；心超结果显示,与sham组相比,手术组EF和FS值明显降低；心肌酶谱检测结果显示,血浆中LDH、CK和CK-MB含量升高；Evans'Blue-TTC染色可以明显地看到变白的梗死区域；HE染色可以看到心梗后2 W,梗死区被大量纤维组织代替。以上检测手段都说明,小鼠心梗模型建立成功。再次,我们在成功建立的小鼠心梗模型的基础上,观察了H_2S对小鼠心梗后血管新生情况和心肌保护作用。免疫组化结果表明,NaHS 50μmol/kg/day腹腔注射2 W能够促进心脏危险区微血管的形成,缓解缺血导致的心功能损伤；而且不同剂量的NaHS腹腔注射4 W都能降低小鼠的死亡率,尤其以NaHS 50 μmol/kg/day给药组小鼠的死亡率最低；ELISA的结果显示,外源性H_2S处理并不改变缺血心肌组织中VEGF的含量；却显著增加CSE、CBS和3-MST的蛋白表达,并且升高血浆中H_2S的含量。接下来,我们利用CSE基因敲除的小鼠,初步观察了内源性H_2S在促血管新生中的作用。结果显示,CSE基因敲除小鼠心梗后,微血管形成数量更少；此时,虽然CBS和3-MST蛋白表达明显升高,但是血浆中H_2S含量更低；同时,心梗后组织中VEGF的含量明显降低。以上结果说明了内源性H_2S在心梗后血管新生中也起到一定的作用。最后,我们利用培养的原代心肌细胞,观察了H_2S对缺氧下心肌细胞的保护作用。LDH和CCK8检测结果显示,缺氧6h后,心肌细胞损伤严重,细胞活力降低；NaHS处理能够明显改善这种状况；western blot和ELISA的结果显示,缺氧后心肌细胞VEGF表达和分泌都升高,但是NaHS并不影响VEGF的表达和分泌；缺氧后心肌细胞内CSE和3-MST蛋白表达不变,CBS蛋白表达明显升高;NaHS处理升高CBS的表达,但是不影响CSE和3-MST的表达。同时,HPLC-MS检测结果显示,缺氧时心肌细胞培液中H_2S含量降低,NaHS处理后能够升高培液中H_2S的含量。利用CSE SiRNA敲低CSE的表达后,CSE蛋白表达降低,同时培液中H_2S含量明显降低；LDH和CCK8检测结果显示,细胞损伤更加严重,说明内源性的H_2S在保护缺氧心肌细胞中的作用。综上所述,本文通过以上一些列实验发现H_2S可以促进大鼠缺血下肢的血管新生,该作用可能和VEGF介导的旁分泌作用有关；H_2S可以促进小鼠心梗后的血管新生,缓解缺血对心脏的损伤,该作用可能和三种酶的表达有关系；内源性H_2S在促进心梗后血管新生中具有重要作用；H_2S可以保护缺氧心肌细胞的损伤,可能和培液中H_2S含量升高有关系,而且内源性的H_2S在其中也发挥重要作用。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363

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