乙醛脱氢酶2缺失加剧内质网应激诱导的心功能不全及其机制研究

发布时间：2020-08-02 16:03

【摘要】：内质网是细胞内一种重要的多功能的细胞器之一,参与细胞内蛋白质的合成和折叠,Ca2+稳态的维持以及脂质的生物合成。许多生理性和病理性应激因素可以诱导内质网应激的发生,如缺血、缺氧、氧化低密度脂蛋白、血管紧张素Ⅱ,肿瘤坏死因子α和脂质代谢状态的改变等。这些应激因素能够减弱内质网蛋白折叠功能和干扰内质网维持内环境稳态功能,导致未折叠蛋白和错误折叠蛋白在内质网中不断积聚,从而引发未折叠蛋白反应,也就是内质网应激。严重或者长时间的内质网应激不但损伤细胞的正常生理功能,还导致细胞的凋亡,参与各种疾病的病理生理过程。近年来,内质网应激越来越受到心血管领域研究的重视,研究发现内质网应激参与了心脑缺血/再灌损伤、动脉粥样硬化、心肌肥厚和心力衰竭等疾病的发生发展过程。因此,内质网应激被认为是病理性细胞功能障碍和死亡的主要触发者,与心血管内环境稳态维持密切相关,提示其可能成为心血管疾病的一个重要的干预靶点。乙醛脱氢酶2(Aldehyde Dehydrogenase-2, ALDH2)是一种四聚体酶,主要表达于肝脏、肺脏以及一些高效产能器官,如心脏和脑。已知其主要作用是醛类物质的解毒作用,包括4-羟基壬烯酸(4-HNE)、乙醛、丙烯醛和短链芳烃或多环芳烃等。作为线粒体内一种重要的醛类氧化酶,近年来研究发现ALDH2通过代谢毒性醛类物质减小缺血引发的心肌损伤,激活ALDH2能够使缺血/再灌所致心肌梗死面积减少60%。此外,越来越多的证据表明ALDH2能够减轻乙醇、乙醛、4-HNE等活性醛类带来的细胞损伤及其诱导的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)。因此,目前ALDH2被认为是一种重要的内源性保护因子,在心血管疾病的发生、发展中发挥着重要的作用。本研究通过ALDH2基因敲除小鼠和构建衣霉素(Tunicamycin)诱导的内质网应激动物模型,研究ALDH2对内质网应激及其诱导的心功能不全的作用,进一步阐述ALDH2对心血管疾病保护性作用的机制。第一部分：ALDH2基因敲除对内质网应激诱导心功能不全的影响目的：采用ALDH2敲除小鼠模型探讨ALDH2对内质网应激及其诱导的心功能不全的作用方法：采用C57野生型小鼠和ALDH2敲除小鼠作为动物来源,腹腔内注射衣霉素(3mg/kg),48h后小动物心超评估心脏功能,Western blot检测Grp78、p-eIF2α、 CHOP的表达,TUNEL法检测心脏组织中的细胞凋亡情况。结果：采用衣霉素腹腔注射小鼠,48h后采用小动物心超评估心脏功能,发现衣霉素能够显著诱导野生型小鼠心脏功能不全。与野生型小鼠相比,ALDH2基因敲除小鼠在衣霉素注射后心功能不全显著恶化,表现为射血分数(EF)和缩短分数(FS)减低,左室收缩末期内径(LVESD)增高,而左室舒张末期内径(LVEDD)无显著性差异。心脏组织Western Blot检测发现衣霉素显著增加野生型小鼠心脏Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平；与野生型小鼠衣霉素处理组相比,ALDH2敲除小鼠在衣霉素处理后,Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平显著增加。TUNEL检测发现野生型小鼠在衣霉素处理后,心肌组织中的凋亡细胞显著增加；与野生型小鼠衣霉素处理组相比,ALDH2基因敲除小鼠处理后心肌组织中凋亡细胞显著增加。结论：ALDH2基因敲除能够使衣霉素诱导的内质网应激标志物蛋白水平及凋亡显著增加,可能介导了心功能不全进一步恶化。第二部分：ALDH2对心肌细胞内质网应激及其介导的凋亡的作用目的：体外实验进一步研究ALDH2对心肌细胞内质网应激及其诱导的凋亡的作用。方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技术,通过衣霉素(5μg/ml)干预心肌细胞12h,Western blot检测Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平,MTT法检测衣霉素诱导的细胞毒性作用,Caspase-3活性检测评估衣霉素对细胞的促凋亡作用。结果：采用Gateway技术,成功构建的ALDH2腺病毒,RT-PCR和测序证实腺病毒载体中ALDH2的序列,荧光显微镜证实病毒转染成功,Western Blot证实ALDH2腺病毒感染后的心肌细胞ALDH2蛋白水平显著增高,ALDH2siRNA能够显著抑制ALDH2的表达。Western Blot证实衣霉素能显著上调的Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA干扰分别抑制和加剧了这一效应。MTT检测发现衣霉素显著诱导心肌细胞毒性作用,Caspase-3活性分析发现衣霉素显著增加心肌细胞的Caspase-3活性,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA干扰分别抑制和加剧了衣霉素诱导的细胞毒性和凋亡。结论：体外实验证实ALDH2能够显著抑制内质网应激及其介导的凋亡,提示ALDH2在心肌细胞内质网应激中发挥着重要的保护性作用。第三部分：ALDH2抑制内质网应激及其介导的凋亡的机制研究目的：研究ALDH2抑制内质网应激及其介导的凋亡的潜在机制方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技术,衣霉素干预心肌细胞后,Westernblot检测p-Akt、Akt和p47phox NADPH氧化酶蛋白水平。采用LY294002抑制PI3-K,Western blot检测衣霉素干预心肌细胞后Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平的变化,MTT法检测衣霉素诱导的细胞毒性作用,Caspase-3活性分析评估衣霉素对细胞的促凋亡作用。结果：衣霉素显著抑制p-Akt的蛋白水平,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA分别逆转Akt的磷酸化水平和进一步抑制了Akt的磷酸化水平。同时,衣霉素显著上调了p47phox亚单位的蛋白水平,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA分别能够显著抑制和进一步加剧衣霉素上调的p47phox亚单位蛋白水平。NAC处理也能有效的阻断衣霉素上调p47phox亚单位蛋白水平。LY294002抑制PI3-K后,ALDH2抑制的Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平无明显变化,然而LY294002能够显著阻断ALDH2抑制衣霉素上调p47phox亚单位蛋白水平的作用。此外,LY294002能够显著ALDH2抑制衣霉素上调Caspase-3活性的作用。结论：ALDH2抵抗内质网应激诱导凋亡的保护性作用可能是通过PI3-K-Akt-p47phox通路所介导。第四部分：4-HNE在ALDH2调节内质网应激的作用目的：阐明4-HNE在ALDH2抑制内质网应激及其诱导的凋亡的作用方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技术,通过衣霉素干预心肌细胞,Western Blot检测4-HNE adducts蛋白水平。采用4-HNE干预心肌细胞,WesternBlot检测Grp78和p-Akt蛋白水平。结果：Western Blot检测发现衣霉素能够显著增加心肌细胞4-HNE修饰蛋白水平,而4-HNE能够显著抑制Akt活性,增加Grp78蛋白水平。结论：衣霉素诱导内质网应激的同时增加心肌细胞4-HNE,后者能够诱导内质网应激和抑制Akt,提示ALDH2能够通过发挥其清道夫作用调控内质网应激及其介导的凋亡作用。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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