应用贝叶斯方法对柯萨奇病毒A组6型分子进化的研究

发布时间：2020-08-02 18:25

【摘要】：背景与目的:手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是一种全球流行的急性传染性疾病,表现为囊泡侵袭5岁以下儿童的手部、足底及口周。大部分患者症状较轻,可以凭借自身的免疫力自愈,但若不加以重视,容易造成脑膜炎和肺水肿等并发症并且危及生命。近年来,手足口病的发病率呈逐年上升的趋势,其致死率也远远超过我国其它C类传染疾病。该病严重危害了儿童的生命健康,由此也引起了中国卫生部门的高度重视。一直以来,肠道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)被广泛地认为是手足口病的主要病原体,而近几年,柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)诱发的手足口病病例逐渐增多。由于二代测序技术的发展,病毒在分子层面的研究不断深入,计算机的发展促使生物信息学技术应运而生,采用计算机方法分析生物学问题已经成为当下流行趋势。应用贝叶斯方法构建的最大可信分支树与其它方法相比具有更准确、更高效等特点。它通过限定最合适的核苷酸替代模型使系统发育树的模型更加精确,同时计算后验概率使最终得出的数据标准化。基于贝叶斯方法的种种优势,研究人员已将其用于病毒的系统发育分析中。在肠道病毒中,基因重组情况普遍存在,病毒通过遗传信息的转移适应环境,产生新的基因型,因此基因重组是病毒变异和进化的重要原因。当下,手足口病的主要病原体EV71的疫苗已应用于临床,CVA16疫苗也在紧张地研发中,然而,关于CVA6疫苗的研发却鲜少报道。因此,本研究深入了解了CVA6的进化趋势以及遗传特征,不仅对手足口病预防和控制具有实用价值,也为疫苗的研发、药物靶位的筛选提供理论基础。材料与方法:本研究共收集了57份长春市2015年手足口病标本,通过逆转录PCR对病毒样本进行分子分型,并对其中11株CVA6 VP1基因进行扩增并测序,将测序结果上传至Genbank。从Genbank中下载353条带有明确分离时间以及地点的CVA6 VP1基因序列,用MEGA剪掉多余序列,进行重组检测、饱和度检测以及选择最适合的核苷酸替代模型。将经过预处理的序列通过贝叶斯方法建立最大可信分支树(maximum clade credibility tree,MCC),并绘制Bayesian skyline plot,分析CVA6 VP1基因的进化特征。从Genbank中下载148条CVA6全基因组序列,经过MEGA比对后用RDP4以及Simplot进行重组分析,进一步探讨CVA6的进化趋势及遗传特征。结果:本研究从57份手足口病样本中分离得到11株CVA6,与原始株相比,测序所得的这11株CVA6 VP1基因核苷酸变异率为16.8%-17.6%,氨基酸变异率为3.3%-6.7%。根据贝叶斯方法构建的最大可信分支树表明1992年至2015年间的CVA6共分为GⅠ-GⅤ五个基因型,GⅣ基因型进一步分为GⅣ-1型和GⅣ-2型,GⅤ基因型进一步分为GⅤ-1型和GⅤ-2型。本研究分离得到的11株CVA6中有10株为GⅤ-2型,1株为GⅣ-2型。中国近年来流行的CVA6为GⅣ-2型和GⅤ-2型,并且以GⅤ-2型为主。CVA6 VP1基因多态性曲线在1999年及2006有明显的上升趋势,在2002年至2005年以及2011年至2015年期间相对平稳。CVA6 VP1基因的进化率为平均每年每个位点发生4.7982E-3次替代事件。CVA6 VP1基因编码的氨基酸的三位密码子的突变率分别为0.303、0.105及2.599。对CVA6全基因组进行重组分析,CVA6在编码结构蛋白的VP1、VP2、VP3、VP4区域中均发生不同程度的型内重组,而在非结构蛋白区,基因重组集中发生于2A、2B和3A区域,并且在22个重组株中,有15株在2B区域发生重组(68.18%)。结论:本研究采用贝叶斯方法,将1992年至2015年间全球CVA6分为GⅠ-GⅤ五个基因型,在2002-2005年以及2011-2015年期间CVA6 VP1基因的遗传相对稳定,并未出现新的基因型。从长春地区分离的CVA6为GⅣ-2基因亚型(1/11,9.09%)和GⅤ-2基因亚型(10/11,90.90%)。CVA6全基因组的重组分析结果表明,CVA6的型内重组在结构蛋白和非结构蛋白编码区均可发生,但在非结构蛋白编码区中重组现象更为普遍。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373
【图文】：

对比图,细胞,对比图,肠道病毒

图 2.1 正常细胞与接入 CVA6 的病变细胞 CPE 对比图。（A）为正常 RD 细胞；（B）（C）（D）为 RD 细胞接入病毒后变圆、聚团、全部漂起的病变状态。（100×）Figure 2.1 Comparison of normal cells and diseased cells with access to CVA6. (A)is normal RD cell; (B) (C) (D) is a lesion state in which the RD cells becomerounded, agglomerated, and completely floated after the virus is inserted.（100×）2.3.2 CVA6 PCR 结果将经过细胞扩增出现病变效应的病毒液收集并用肠道病毒通用引物、CVA6特异性引物和 CVA6 VP1 引物进行 RT-PCR 扩增。结果显示，26 份出现肠道病毒典型病变效应的样本利用肠道病毒通用引物（EV）进行 RT-PCR 后均在 435bp有目的条带，而其中有 11 份样本利用 CVA6 特异性引物（CVA6S）进行 RT-PCR

效果图,效果图,肠道病毒,电泳

2图 2.2 PCR 效果图。（A）（B）为肠道病毒通用引物 PCR 结果图。（C）为11 株 CVA6 特异性引物 PCR 电泳结果图。为（D）11 株 VP1 基因 PCR 电泳结果图。 M：DL2000 Marker。Figure 2.2 PCR electropherogram. (A) (B) shows the results of PCR with 26common strains of enteroviruses. (C) PCR results of 11 CVA6-specific primers(D) PCR results of eleven strains of CVA6 VP1 gene. M: DL2000 Marker.

测序,序列信息

表 2.1 26 份肠道病毒样本病原体组成Table 2.1 The pathogens of 26 enterovirus sample病毒种类 EV71 CVA16 CVA6阳性标本数 5 6 11所占比（%） 19.23 23.08 42.312.3.3 CVA6 VP1 测序结果将经过纯化的 CVA6 VP1 的 PCR 产物送到上海生工生物工程公司进行双向测序，结果如图，峰图无重叠代表测序成功，如图 2.3，并将测序成功的 11 株CVA6 VP1 的序列信息上传至 Genbank。具体序列信息见表 2.2。

【参考文献】