结核分枝杆菌毒素Rv2872促进重组菌耐受万古霉素和影响生物膜形成的分子机理

发布时间：2020-08-07 03:23

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌感染导致的一种严重危害公共健康具有高传染性和高死亡率的慢性传染病。近年来出现了越来越多的广泛耐药的结核菌(XDR)、耐多药的结核菌(MDR)、全耐药的结核菌(TDR),使得结核病的防治和治疗更加的困难,于是我们急需探索治疗结核病的新方法,寻找新的治疗结核病的抗生素药物。最早研究人员是在质粒的稳定系统中发现毒素抗毒素系统的。在环境压力条件下,由于基因表达的抑制和蛋白酶的降解作用,不稳定的抗毒素减少,从而产生游离的稳定的毒素蛋白,导致细菌的生长抑制或者死亡。在结核分枝杆菌H37Rv中研究共确定了79对毒素抗毒素系统,VapBC毒素抗毒素系统在结核分枝杆菌中数量最多。毒素蛋白VapC具有核糖核酸酶共有的PIN区域(与PilT N-terminal区域同源),VapB是结构域的抑制剂。VapBC毒素抗毒素系统在结核分枝杆菌中的作用很大程度上是未知的,对结核病研究具有重大的意义。先前研究报道结核分枝杆菌Rv2872具有PIN结构域,是预测的VapC家族的毒素,在多种抗生素环境下上调表达,Rv2872可能与结核分枝杆菌持留和耐药相关并且可能具有RNA酶活性。为了探究Rv2872在结核分枝杆菌中的作用,我们构建了重组耻垢分枝杆菌(MS_Rv2872)和空载菌(MS_Vec)。我们发现过表达Rv2872能够抑制耻垢分枝杆菌的生长。这与我们之前发现的毒素作用是一致的。已有研究发现用不同浓度的万古霉素处理结核分枝杆菌后多个毒素基因上调表达,我们的研究结果证明MS_Rv2872对万古霉素耐受,这说明Rv2872可能通过某些途径调控某些耐药基因的表达从而对万古霉素具有耐受性。先前研究报道万古霉素处理结核分枝杆菌后差异表达的基因包括100多个,我们通过荧光定量PCR检测了其中在耻垢分枝杆菌中具有同源基因的几个基因在重组菌MS_Rv2872和MS_Vec中的表达情况。我们发现Rv2872表达导致MSMEG_Rv0051和MSMEG_2694两个基因转录水平上调,MSMEG_0424,MSMEG_1764,MSMEG_4979三个基因转录水平下调。之前研究发现MSMEG_0424,MSMEG_1764,MSMEG_4979三个基因在万古霉素处理条件下表现出不同程度的敏感。为了进一步探究MSMEG_Rv0051和MSMEG_2694这两个基因是否与万古霉素敏感相关,我们构建了这两个基因在耻垢分枝杆菌中的的过表达菌株,用万古霉素处理这些重组菌后,发现这些过表达菌株均对万古霉素有不同程度的耐受。同时我们研究发现MSMEG_2916是万古霉素耐受基因MSMEG_0051的转录调控因子,MSMEG_2916可负调控MSMEG_0051。纯化的Rv2872毒素蛋白可以直接剪切MSMEG_2916的RNA,从而下调MSMEG_2916的转录水平,从而上调MSMEG_0051的转录水平,导致万古霉素耐受。Rv2872在重组耻垢分枝杆菌中也引起其他显著的表型改变,如改变细胞壁结构、改变体内氨基酸的含量和细菌生物膜的组成等。同时生物膜形成相关基因MSMEG_6092的RNA也能直接被Rv2872蛋白剪切,引起MSMEG_6092转录水平的下降,导致MS_Rv2872的生物膜改变。研究发现,Rv2872表型的改变,都可能是由于Rv2872的特异核糖核酸酶活性导致相关基因转录水平的改变。Rv2782在细菌生理、遗传学和发病机制中,作为重要的因子,这种作用与已证明的毒素抗毒素系统的作用功能是一致的。同时我们的研究也第一次报道毒素Rv2872为一种特定序列的核糖核酸酶,涉及抗生素的应激反应和生物膜的形成。针对Rv2872毒素的抑制剂可能是万古霉素和其他针对细胞壁生物合成的抗生素的理想潜在药物。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.911
【图文】：

系统分类,抗毒素,蛋白质

所有细菌毒素抗毒素系统中，抗毒素是蛋白质或小RNA(sRNAs)，而毒素总是蛋白质。根据相互作用的不同毒素抗毒素系统，分为6种类型（图1.1）[7]。Ⅰ型和Ⅲ型毒素抗毒素系统中抗毒素都是RNA，而其他几种类型中抗毒素都是蛋白质[8]。图1.1 毒素抗毒素系统分类Figure 1.1 Toxin Antitoxin Systems Classification

转录组,抗生素,转录水平,结核分枝杆菌

是我们从GEO中下载并分析了多种抗生素处理下结核分枝杆菌基因的转录组数据(GSE1642)[61]。研究发现，在20种不同抗生素处理下，76个毒素基因在转录水平上差异表达。如图4.1所示，在多种抗生素处理下，多个毒素基因在转录水平上上图 4.1毒素抗毒素基因暴露在不同抗生素下的转录组分析。Figure 4.1 The transcriptional response of M. tuberculosis toxin genes to antibiotics exposure. Eachcolumn is the average of several microarray experiments using the same drug treatment, each box within a row is theaverage for all genes assigned to the same gene cluster. The inset shows a color scale for z-scores.

家族,蛋白

图 4.2 VapC家族蛋白在结核菌中不保守。Fig4.2 VapC family proteins in M. tuberculosis is not conservative.Sequence obtained from NCBI searchand aligned using ESPript (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi).4.3 成功构建表达 Rv2872 基因的重组耻垢分枝杆菌我们以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板，以F1、R1为特异性引物，进行PCR扩增，PCR结果用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。已知，Rv2872目的基因的大小为444bp，如图所示，在250-500 bp之间有一条明显的与目的片段大小一致的条带（图4.3A）。其中DNAMarker为DL2000。通过BamH I和Cla I限制性内切酶对Rv2872和pALACE质粒进行双酶切（体系如表5），胶回收酶切产物，再利用DNA连接酶将其连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α细胞中，然后通过菌液PCR再次验证Rv2872基因与pALACE质粒成功连接。提取重组质粒送华大公司测序，DNAMAN比对测序结果显示重组质

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