力学刺激对巨噬细胞极化的影响及机制研究

发布时间：2020-08-08 18:41

【摘要】：目的:本文通过动态(不同幅度拉伸)和静态力学(不同弹性模量水凝胶)刺激巨噬细胞(Macrophage),探究不同力学刺激对巨噬细胞极化的影响及其相关机制。方法:用胶原蛋白I型(collagenⅠ)处理细胞拉伸皿,及制备不同弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶,将小鼠巨噬细胞分别接种到细胞拉伸皿和水凝胶表面。部分一:不同幅度拉伸作用于巨噬细胞后:1)、通过活/死细胞染色和细胞计数检测细胞的生长状况。2)、流式细胞实验分析巨噬细胞表面标志物的表达,用荧光探针DCFH-DA(活性氧检测试剂盒)进行巨噬细胞内活性氧水平的检测,采用实时定量PCR(RT-PCR)及酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)分别检测巨噬细胞及培养上清中炎症和抗炎相关基因的m RNA及蛋白表达。3)、采用Western Blot方法比较不同幅度拉伸对巨噬细胞中NF-κB信号通路的激活影响。部分二:巨噬细胞接种于不同弹性模量水凝胶后:1)、采用活/死细胞染色及CCK-8方法检测不同弹性模量的水凝胶对巨噬细胞生长的影响,使用扫描电子显微镜(SEM)观察细胞在不同弹性模量水凝胶上的形貌特征。2)、流式细胞仪分析巨噬细胞M1及M2表面标志物的表达,用荧光探针DCFH-DA进行巨噬细胞内活性氧水平的检测,采用实时定量PCR(RT-PCR)及酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)分别检测巨噬细胞及培养上清中炎症和抗炎相关基因的m RNA及蛋白表达。3)、Western Blot比较不同弹性模量对巨噬细胞中NF-κB信号通路的激活影响。结果:部分一:1)、经2%、5%和12%幅度拉伸巨噬细胞后,活/死细胞染色实验结果得到12%幅度拉伸会损伤细胞的生长,其它3组(未拉伸0%、2%和5%幅度拉伸)对细胞的生长均没有影响。2)、流式细胞实验结果显示,5%幅度拉伸显著增加CD206/CD86的比值,同时细胞内活性氧的水平显著下降,证明巨噬细胞向M2方向极化;RT-PCR和ELISA检测结果实验数据显示,5%幅度作用巨噬细胞后,巨噬细胞的炎症因子(IL-1β、IL-6和i NOS)m RNA和炎症因子(IL-1β和TNF-α)的分泌明显下调,抗炎基因(IL-4、IL-10和TGF-β)的表达和抗炎因子(IL-4和IL-10)明显升高;3)、5%幅度拉伸引起巨噬细胞内NF-κB信号通路的相关蛋白表达量减少,表明NF-κB信号通路的激活被抑制。部分二:1)、活/死细胞染色和CCK-8实验证明不同弹性模量水凝胶以及材料浸出液不影响细胞的粘附和增殖。2)、巨噬细胞接种到不同弹性模量水凝胶上,随着弹性模量的增加,巨噬细胞表面CD206/CD86分子表达越来越高,低弹性模量组的巨噬细胞表面CD206分子表达量最低,细胞内活性氧表达量最少,表明低弹性模量组的巨噬细胞向M1方向极化,多为M1型巨噬细胞;巨噬细胞的炎症因子(IL-1β和IL-6)m RNA和炎症因子(IL-1β和TNF-α)分泌随着弹性模量的增加而明显下调,抗炎基因(Arg-1和TGF-β)和抗炎因子(IL-4和TGF-β)的表达明显升高;3)、低弹性模量组巨噬细胞内NF-κB信号通路的相关蛋白表达量最高,表明低弹性模量可以促进NF-κB信号通路的激活。结论:合适的拉伸幅度抑制NF-κB信号通路从而引起巨噬细胞向M2型极化,低弹性模量通过激活NF-κB信号通路而刺激巨噬细胞向M1型极化。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

形态图,巨噬细胞,形态图

力学刺激对巨胞，前单核细胞会在外周血的环境下分穿过血管，迁移到不同的器官组织或体腔育为巨噬细胞，具有高度的异质性和可塑织内巨噬细胞被赋予不同的表型、名称与(alveolar macrophages)、脑组织中的小胶否细胞 (Kupffer cell) 以及骨组织中发挥细胞可以吞噬和清除衰老的红细胞，空细胞与许多神经退行性疾病和脑部炎症性是消灭病原微生物、整理清除机体内的内

巨噬细胞,炎症因子

图 2：M1 和 M2 型巨噬细胞的特点[35]巨噬细胞主要在 NK、Th1 等释放的 IFN-γ 或细菌脂多糖（LP来。M1 型肿瘤相关巨噬细胞（Tissue-associated macrophage胞表面抗体的引导下将肿瘤杀死[21, 36, 37]。M1 型 TAM 在发过释放多种炎症因子（TNF-α、IL-6、IFN-γ）和免疫激活因子、免疫活化反应以及细胞吞噬功能杀伤肿瘤细胞[36, 38]。M1F-α 等因子作为炎症反应初期的启动因子，诱发 IL-1β、IL-6、的产生，损伤体内器官或显著促进破骨细胞活性的增加[39]。性期蛋白，同时还能促使 B 细胞和 T 细胞分化增生，促进免性期反应，造成组织破损[40]。M1 型巨噬细胞是 Th1 型反应量的炎症因子，杀伤微生物和肿瘤细胞[41]。巨噬细胞主要分泌一些抗炎（TGF-β、IL-4 等）、促血管（VEG炎反应、血管生成以及参与组织重塑和修复等过程[41]。M2

巨噬细胞,炎症反应

力学刺激对巨噬细胞极化的影响及机制研究研究背和内皮细胞增殖[44, 45]。M2 型 TAM 在肿瘤方面发挥与 M1 型 TAM 相反的功能M2 型 TAM 会促进肿瘤的生长与发展，一方面 M2 型 TAM 通过分泌 VEGF、PDGIL-17 等促进肿瘤细胞新生血管的形成，还可以释放许多血管活性物质如 P 物质、管通透因子、前列腺素 E 等增加血管的通透性，促进肿瘤的生长[46];另一方面，M型 TAM 还能阻断 iNOS 途径，减少 NO 的合成，促进多胺类物质的产生，进而促肿瘤细胞的增殖，M2 型 TAM 还可以通过分泌的 IL-10、TGF-β 等抗炎因子抑制细毒性 T 淋巴细胞和 NK 细胞的激活，降低二者对肿瘤细胞的杀伤作用，间接促进肿细胞的增殖[47-50]。M2a 型巨噬细胞主要参与 Th2 型免疫反应，M2c 型巨噬细胞要发挥抑制免疫和炎症反应的功能[51]。M2 型巨噬细胞可以抑制炎症反应，促进织修复和再生，同时 M2 型巨噬细胞也能够肿瘤细胞生长与转移。总之两种型巨噬胞的功能有利有弊，我们要根据疾病的需求来适当的诱导激活巨噬细胞。

【参考文献】