T细胞受体的核心岩藻糖基化调节双阳性（DP）阶段的胸腺发育

发布时间：2020-08-09 06:17

【摘要】：背景:在胸腺中,T细胞的增殖和分化需经过一系列具有特异性表达和调节的基因的多重检查点的严格调控。胸腺细胞分为以下几个阶段:DN(CD4~-CD8~-Double-negative,双阴性)阶段,DP(CD4~+CD8~+Double-positive,双阳性)阶段和CD4 SP(CD4~+CD8~-single-positive,CD4单阳性)和CD8 SP(CD4~-CD8~+single-positive,CD8单阳性)阶段。其DN阶段又根据复杂的调控,并且最终以CD44和CD25为细胞表面标志进行具体的划分,包括DN1(CD25~-CD44~+),DN2(CD25~+CD44~+),DN3(CD25~+CD44~-)和DN4(CD25~-CD44~-)阶段。TCR(T cell receptor,T细胞受体)能够诱导胸腺细胞存活、增殖和分化的不依赖配体的激活信号的活化。TCR在胸腺细胞的分化发育过程中同样也发挥了重要的作用。TCR是富含核心岩藻糖基化的糖蛋白。Fut8(core fucosyltransferase,核心岩藻糖基转移酶)介导的核心岩藻糖基化是一种重要的翻译后修饰过程,并且已显示了其修饰对于细胞表面上各种糖蛋白分子的功能和稳定性是必需的。Fut8通过核心岩藻糖基修饰能改变底物蛋白的构象、表达及定位,在哺乳动物细胞中发挥了重要作用。目的:利用Fut8基因敲除(Fut8~(-/-))小鼠与正常(Fut8~(+/+))小鼠,探究Fut8在小鼠胸腺中T细胞的分化发育的调节作用,主要探究TCR的核心岩藻糖基化对于胸腺DP阶段发育的重要性。方法:将4~8周龄的Fut8~(+/+)小鼠的胸腺细胞进行分选,利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter,流式细胞仪)检测不同发育阶段的细胞表面的核心岩藻糖基化。利用同窝出生的Fut8~(+/+)和Fut8~(-/-)小鼠为对象,通过流式细胞仪分选出各个阶段DN1、DN2、DN3、DN4、DP CD4 SP及CD8 SP的细胞,然后进行计数,并探究核心岩藻糖基化的缺失对小鼠胸腺细胞发育不同阶段的细胞数目的影响。利用IP(Immunoprecipitation,蛋白免疫沉淀),Western Blot(蛋白质免疫印迹)和FACS检测DP细胞TCR及TCR上核心岩藻糖基化的差异。在利用Western Blot检测DP细胞磷酸化的水平后,为了进一步探究TCR核心岩藻糖基化在DP阶段的作用,我们利用特异性切割核心岩藻糖糖苷键(β1-6)的糖苷酶处理TCR特异性转基因OT-I和OT-II小鼠的DP细胞,再利用Western Blot检测TCR的核心岩藻糖基化的改变对信号转导的影响,同时也利用MTT和细胞克隆形成实验检测细胞的增殖能力。最后利用Q-PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,荧光实时定量聚合酶链式反应)检测与胸腺发育相关的转录因子的变化。结果:通过流式结果分析发现核心岩藻糖基化在胸腺细胞不同发育阶段的表达是一个动态变化的过程,其在胸腺细胞在由DN阶段向DP阶段转变过程中显著增多。核心岩藻糖基化的缺失导致胸腺中DP细胞数目明显减少。对DP胸腺细胞的研究结果表明,与Fut8~(+/+)DP细胞相比,Fut8~(-/-)DP细胞的增殖能力及磷酸化水平明显减弱。并且我们发现,TCR上核心岩藻糖基化的缺失,会使TCR的信号转导能力下降,并且细胞增殖也减弱。Q-PCR结果显示,Fut8~(-/-)DP细胞中与胸腺细胞分化密切相关的转录因子Id2及E2a的表达异常。结论:在小鼠胸腺中,核心岩藻糖基化修饰在T细胞的正常分化中发挥重要调节作用,并且发现TCR的核心岩藻糖基化对调节DP阶段的胸腺发育至关重要。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

结果1. 核心岩藻糖基化在整个胸腺细胞分化过程中的动态变化糖基化能够影响 T 细胞的发育，生存和相关的代谢反应[6-11]。为了检测核藻糖基化在胸腺发育中可能存在的调节作用，我们利用能够特应性识别核心岩糖基化结构的 LCA 对分选出的 Fut8+/+小鼠的不同发育阶段的胸腺细胞进行染利用细胞表面标记物，CD4 和 CD8 进行细胞染色后，分选 DN、DP、CD4 SP、SP 细胞，然后将 DN、DP、CD4 SP、CD8 SP 细胞分别进行 LCA 染色。利用 Fl进行分析后发现，Fut8+/+小鼠 DP 比 DN 胸腺细胞的核心岩藻糖基化水平显著（**P<0.01）（图 1.1A）。同时在胸腺细胞发育 CD4 SP、CD8 SP 阶段，核心岩基化水平仍然保持着较高的水平（图 1.1B）。

大连医科大学硕士学位论文binding on thymic subpopulations (n=6). (**p＜0.01)2. Fut8-/-胸腺细胞表面的核心岩藻糖基化消失我们将对 Fut8+/+和 Fut8-/-胸腺细胞进行流式细胞分析，比较 Fut8+/+和 Fut8-/-胸腺细胞各发育阶段的 LCA 染色情况。Fut8-/-胸腺细胞在 DN、DP、CD4 SP 及 CD8 SP阶段的 LCA 染色为阴性（图 1.2）。虽然 Fut8+/+DN、DP、CD4 SP 及 CD8 SP 阶段表达情况不同，但各阶段细胞均显示 LCA 染色阳性。

结果1. Fut8-/-小鼠显示胸腺发育异常为了探索在小鼠体内 Fut8 与胸腺发育的关系，我们将同窝出生四周的 Fut8+/和 Fut8-/-小鼠的全胸腺进行对比，如图 2.1A 所示，Fut8-/-小鼠胸腺较 Fut8+/+小鼠的胸腺明显偏小。通过 HE 免疫组化染色分析，Fut8-/-小鼠的髓质明显减少(图 2.1B)因为髓质中分布有较成熟的胸腺细胞，因此推测 Fut8-/-小鼠较成熟胸腺细胞的数量会受到影响。LCA 的染色结果显示，Fut8+/+小鼠的整个胸腺中核心岩藻糖基高表达而 Fut8-/-小鼠中则几乎没有表达(图 2.1B）。通过胸腺细胞全蛋白的 AAL[24]和 LC染色，我们发现在 Fut8-/-鼠中核心岩藻糖基化消失(图 2.1C)。说明 Fut8 的缺失与胸腺分化发育密切相关。

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本文编号：2786731