人脐带间充质干细胞体外诱导分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞治疗肺纤维化小鼠模型及机制初探

发布时间：2020-08-09 11:32

【摘要】：第一部分体外诱导人脐带间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化目的:本研究旨在通过条件培养基诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)向Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC2s)分化,为后续研究h UC-MSCs来源的AEC2s在肺部疾病中的治疗作用奠定基础。方法:h UC-MSCs分为实验组和对照组,实验组用小气道上皮细胞生长基础培养基培养2天后添加生长因子诱导培养;对照组用20%血清的DMEM/F12培养。第14天观察细胞形态;Western blot、免疫荧光、流式细胞术和ELISA法检测肺泡表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)及前肺泡表面活性蛋白C(pro-surfactant protein C,pro SP-C);透射电镜观察板层小体。结果:实验组细胞形态由长梭形向多边形转变,细胞内有pro SP-C明显表达,培养基上清中有SP-C分泌,透射电镜观察到板层小体;而对照组细胞形态无明显改变,未检测到pro SP-C表达、SP-C分泌和板层小体形成。结论:本研究结果表明体外诱导培养可促进h UC-MSCs向AEC2s分化,通过该方法有望大量获得h UC-MSCs来源的AEC2s用于肺部疾病治疗研究。第二部分诱导来源Ⅱ型肺泡上皮细胞对肺纤维化模型小鼠的治疗作用及机制初探目的:建立博来霉素(Bleomycin,BLM)引起的肺纤维化小鼠(pulmonary fibrosis,PF)模型,观察诱导来源Ⅱ型肺泡上皮细胞(h UC-MSCs-derived AEC2s)对肺纤维化模型小鼠的治疗作用,讨论其中可能的机制。方法:将C57BL/6小鼠分为空白对照组、安全性对照组、肺纤维化模型组、治疗组,每组8只小鼠。10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉后行气管插管。肺纤维化模型组及治疗组滴入博来霉素3 mg/kg,向空白对照组和安全性对照组滴入生理盐水50μl。造模后第7 d,使用相同方法麻醉并气管插管后,治疗组及安全性对照组滴入h UC-MSCs-derived AEC2s细胞悬液,空白对照组及肺纤维化模型组滴入生理盐水40μl。第21 d处死小鼠并采集标本。统计生存率,观察肺组织病理改变,分析肺组织胶原含量的变化及相关纤维化蛋白的表达,免疫组化检测pro SP-C表达。将h UC-MSCs-derived AEC2s和A549细胞进行共培养,探讨h UC-MSCs-derived AEC2s对A549增殖的影响。结果:经气管插管给予博来霉素的肺纤维化模型组,与空白对照组比较,H.E染色显示肺泡间隔增厚,Masson染色显示纤维条索增加,并且肺内胶原含量上升,肺内α-sma和vimentin等纤维标志物表达增强,表明博来霉素小鼠模型构建成功。h UC-MSCs-derived AEC2s治疗肺纤维化模型小鼠,提高了其生存率,肺组织病理学显示肺间隔增厚程度得到改善,肺内炎性细胞聚集减少,胶原含量明显降低,α-sma和vimentin表达下降,肺内pro SP-C表达增加。体外实验发现h UC-MSCs-derived AEC2s可以促进A549增殖。结论:h UC-MSCs-derived AEC2s可以改善博来霉素所致小鼠肺纤维化程度,有可能是通过促进AEC2s增殖所起的作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.6;R-332
【图文】：

形态图,光镜,形态,阶段

样品脱水和包埋。超薄切片后在日立 H-7500 透射电镜下观察拍照。.2.9 数据统计运用 SPSS 11.5 软件进行显著性差异分析，实验数据以均数±标准差（X示，两组之间均数比较采用 t 检验，当 p＜0.05 时认为差异有统计学意义。2 结果.1 细胞形态在 DMEM/F12 培养基中培养至第 4 代的 hUC-MSCs 在光镜下呈长梭形，不一向外伸出的突起并且在细胞生长过程中可以观察到螺旋状汇合。在小皮细胞生长基础培养基培养 2 d 后，细胞间连接改变。在条件培养基培养4 d 可明显观察到细胞骨架，细胞形态由长梭形转变为扁平状，将细胞消化铺板，在贴壁后可观察到细胞呈不规则多边形并有立体感。0 d 2 d

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重庆医科大学硕士研究生学位论文MSCs 诱导前后细胞干性检测表面间充质干细胞标志物检测EM/F12 培养基中培养的 hUC-MSCs 表面分子 CD34、CD45 2%，CD73、CD90、CD105 阳性率高于 95%，符合 2006 年发布的标准[10]。诱导来源的 AEC2s 表面 CD34、CD45、HL2%, CD73 和 CD105 阳性率明显降低，低于 80%, CD90 阳性95%。

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26图 1-3 诱导来源的 AEC2s 表面间充质干细胞标志物Figure1-3 hUC-MSCs-derived AEC2s CD marker分化EM/F12 培养基中培养的 hUC-MSCs 通过诱导可以分化细胞。而诱导来源的 AEC2s 不能在成骨、成脂或成软骨

【参考文献】