人△42PD1特异性单克隆抗体的制备及其免疫功能的初步探讨

发布时间：2020-08-10 20:59

【摘要】：程序性细胞死亡受体1 (programmed cell death 1, PD1),是属于CD28/CTLA-4家族的一种免疫受体分子,通过与其配体PD-L1或PD-L2相互作用,该分子可下调T细胞受体和B细胞受体介导的信号通路。PD1/PD-L由的生理意义涉及到免疫应答的各个方面,包括自身免疫、肿瘤免疫、感染免疫、抑制免疫、变态反应和免疫自稳等。之前,其他课题组已经发现了4种可诱导表达的PD1剪接异构体,然而这些异构体的功能却不是很清楚。弄清楚这些PD1异构体的功能是研究PD1免疫调节功能的关键环节,且有利于为疾病治疗和疫苗开发提供新的思路。最近,我们发现了PD1的一种新型剪接异构体,并将其命名为A42PD1。与PD1不同,Δ42PD1不能结合PD-L1和PD-L2,也不被常用的几株商业化PD1特异性单克隆抗体所识别。可溶性A42PD1 (sA42PD1)重组蛋白可在体外诱导PBMCs分泌前炎性细胞因子,在体内增强CD8+ T细胞免疫反应,表明Δ42PD1是一种功能性免疫调节分子。特异性识别Δ42PD1而不识别PD1的单克隆抗体,是进一步研究这一新发现的免疫分子生理功能的关键。本研究旨在制备鼠抗人Δ42PD1单克隆抗体,以便于对该新发现免疫分子的功能进行研究。为了便于抗体的筛选,我们首先通过稳定转染的方法分别构建了稳定表达人PD1和Δ42PD1的293T细胞系,通过有限稀释法获得单克隆细胞并分别命名为293T-PDl和293T-Δ42PD1,目的基因的表达通过流式细胞仪、Western blot和RT-PCR的方法得以证实。免疫原的制备,我们采用293F真核表达体系表达重组蛋白sΔ42PD1Fc(由人sΔ42PD1与兔IgG1 Fc段融合而成),通过重组proteinG来纯化免疫原。采用DNA初次免疫/蛋白质加强免疫的策略,先后用sΔ42PD1Fc重组质粒和重组蛋白免疫BALB/c小鼠。流式细胞术分析免疫小鼠血清分别与293T-PD1和293T-A42PD1结合情况,结果发现免疫血清与293T-A42PD1的结合显著性高于与293T-PDl的结合,表明PDl和A42PD1分子间存在免疫原性的巨大差异。最后一次免疫后,处死免疫小鼠,取脾细胞,通过传统单克隆抗体制备的方式与SP2/0细胞进行融合。通过间接ELISA的方法筛选出两株分泌抗人A42PD1单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别被命名为CH34和CH101。流式细胞术的结果显示,抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101能特异性识别人A42PD1而不识别PD1,而Western blot结果发现二者都能结合变性的人PD1和△42PD1但不能识别小鼠PD1。通过酵母表面展示、细胞内染色A42PD1截短蛋白和多肽ELISA等方法鉴定出单克隆抗体CH101所识别的表位。通过PR-PCR的方法克隆了单克隆抗体CH34和CH101的重链可变区和轻链序列并进行了测序。通过细胞内染色和流式细胞术的方法,我们鉴定出CD14+单核/巨噬细胞在受到重组蛋白sΔ42PD1Fc的刺激后分泌前炎性细胞因子。抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101都不能阻断重组蛋白sΔ42PD1Fc刺激单核细胞产生前炎性细胞因子的过程。基于293T-A42PD1细胞的研究发现,A42PD1与PD1一样,在与PBMCs表面表达的配体结合后可抑制细胞内AKT信号通路的活化。抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101在与293T-A42PD1细胞结合后,并不会触发A42PD1向细胞内传递信号。且单克隆抗体CH34和CH101也不会阻断PBMCs表面某种未知配体对A42PD1信号通路的激活。相反,单克隆抗体CH101似乎还能够增强PBMCs表面某种未知配体对A42PD1信号通路的激活作用。基于抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101,我们建立了双抗体夹心ELISA的方法,可特异性检测体液中sA42PD1,而不受sPD1的干扰。利用这种方法我们发现,与健康人相比,HIV感染者血浆中sΔ42PD1水平显著性增高。这一结果提示sΔ42PD1可能在HIV感染过程中起到一定的作用。PD1诱导性表达于活化的T细胞和B细胞表面,通过抑制TCR和BCR信号通路调节适应性免疫应答。类似的是,Δ42PD1表达于骨髓来源的固有免疫细胞表面,可能通过其抑制性信号通路调节固有免疫应答。有意义的是,我们制备了抗人Δ42PD1的单克隆抗体,为深入研究其免疫功能奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【图文】：

稳定表达,细胞系

在９６孔板内筛选出的嘿岭霉素抗性单细施克隆进行筛选。我们筛选出ＰＤ１和逡逑Ａ４２ＰＤ１分子在细胞表面表达量最高的单细胞克隆，并分别将之命名为２９化ＰＤ１逡逑和２％Ｔ－Ａ４２ＰＤ１细胞。如图２．１Ａ所示，Ｗ邋２９３Ｔ细胞微阴性对照，２％Ｔ－ＰＤ１细逡逑胞能够被抗ＰＤ１多克隆抗体和４种ｍＡｂ所识别。而２９３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１细胞只能被抗逡逑ＰＤ１多克隆抗体而不能被４种ｍＡｂ所识别。这一结果表明Ａ４２ＰＤ１与ＰＤ１分子间逡逑结果有很大的差异，该结论同我们之间发表的数据相吻合。逡逑为了进一步确证目的基因的表达，我们分别提取了邋２９３Ｔ、２９３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１和逡逑２９化ＰＤ１细胞总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测目的基因的表达情况。结果如图逡逑２．１邋Ｂ所示，在内参ＧＡＰＤＨ表达量相当的情况下，２９３Ｔ细胞内检测不到ＰＤ１逡逑和Ｍ２ＰＤ１邋ｍＲＮＡ的转录，２９３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１和２９３Ｔ－ＰＤ１细胞内，ＰＣ民扩增出逡逑高丰度的目的基因，表明目的基因在细胞内得到高水平的转录，与流式细胞术检逡逑测到的蛋白水平的结果相一致。总之，Ｗ上的数据表明，筛选出来的２９３Ｔ－ＰＤ１逡逑和２ＷＴ－Ａ４２ＰＤ１单克隆细胞株能够稳定、高水平地表达目的蛋白

氨基酸序列,免疫血清,小鼠,重组蛋白

的重组蛋白ｓＡ４２ＰＤｌｈ和ｓＡ４２ＰＤ１ｈｉｓ溶解于１邋ｍｌＰＢＳ溶液中，用ＢＣＡ法测定浓度。逡逑８么４２口０１＾：和５么４２？０１１＆浓度分别为：０．７ｍｇ／ｍ巧日０．２５ｍｇ／ｍｌ。各取２＾１１纯化的逡逑重组蛋白经Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ鉴定，结果如图２．２邋Ａ所示，在预期位置看到了ｓＡ４２ＰＤｌｐｃ逡逑和ｓＡ４２ＰＤｌｆｆｉｓ的特异性条带，表明蛋白表达纯化成功，纯化的蛋白冻存于－８０°Ｃ逡逑冰箱，Ｗ备后续的免疫动物Ｗ及分析血清效价等实验所用。逡逑在氨基酸序列上，人与小鼠ＰＤ１具有６０％同源性，有可能导致人Ａ４２ＰＤ１较逡逑难在小鼠体内诱导出较强的体液免疫反应。因此我们采用ＤＮＡ初次免疫、蛋白逡逑加强免疫的免疫策略期诱导出较强的抗体反应如图２．２邋Ｂ所示，采用质粒逡逑ＤＮＡ＋电穿孔的方法，分别于第０和第３周免疫２次。然后在第６和第９周分别逡逑给予重组蛋白＋弗氏佐剂加强免疫２次。四免后一周（初次免疫后第１０周）面静逡逑脉采集小鼠血液，制备抗血清Ｗ便分析。由于免疫原中包含了免疫原性较强的兔逡逑ＩｇＧｌ邋Ｆｃ段，因此我们用Ａ４２ＰＤｌ？ｉ；取代Ａ４２ＰＤｌｐｅ包被ＥＬＩＳＡ板，分析血清Ａ４２ＰＤ１逡逑抗体的效价

结合能力,亚克隆,细胞膜,杂交瘤细胞系

２？义３鼠抗人Ａ４２ＰＤ１邋ｍＡｂ筛选逡逑免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合２周后，取培养上清，间接ＥＬＩＳＡ法筛选逡逑分泌Ａ４２ＰＤ１特异性抗体的杂交瘤细胞。结果如图２．３邋Ａ所示，ＣＨ３４、ＣＨ３６、ＣＨ７８、逡逑ＣＨ９６和ＣＨ１０１等５个克隆的培养上清能够结合Ａ４２ＰＤｌｆｆｉｓ蛋白，且吸光度值都逡逑高于阳性对照。因此，对这５个克隆进行亚克隆，期建立稳定的细胞系。但在逡逑亚克隆过程中，克隆ＣＨ％丢失，没能筛选出稳定的杂交瘤细胞系。逡逑考虑到Ａ４２ＰＤ１胞外区与完整的细胞膜表面的Ａ４２ＰＤ１分子会有一定的差异，逡逑因此我们用流式细胞术的方法检测了邋ＣＨ３４、ＣＨ３６、ＣＨ７８和ＣＨ１０１等４株ｍＡｂ逡逑对膜表面Ａ４２ＰＤ１分子的结合能力。结果如图２．３邋Ｂ所示，Ｗ邋２９３Ｔ细胞为阴性逡逑对照，克隆ＣＨ３４和ＣＨ１０１与巧３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１细胞有较强的结合能力，而克隆ＣＨ７８逡逑和ＣＨ３６与细胞膜表面Ａ４２ＰＤ１的结合能力较弱。因此，我们选择克隆ＣＨ３４和逡逑ＣＨ１０１为后续的研究对象。逡逑为了后续研究的需要

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