炭疽水肿毒素抑制巨噬细胞功能的分子机制研究

发布时间：2020-08-15 09:03

【摘要】：炭疽是一种人畜共患的烈性传染病,其病原菌是炭疽芽孢杆菌。炭疽芽孢曾多次被用于生物恐怖袭击,也是潜在的生物战剂。深入认识炭疽芽孢杆菌的感染与致病机制,有助于炭疽预防与治疗新方法的发现,对维护生物安全有重要意义。炭疽芽孢杆菌的毒力因子主要包括荚膜和毒素。炭疽毒素包含三种蛋白质成分:保护性抗原(PA),致死因子(LF)以及水肿因子(EF)。致死毒素(LT)由LF和PA构成,LF借助PA进入细胞,通过剪切丝裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK)1-4、6和7而使相关通路失活。水肿毒素(ET)由EF与PA构成,EF借助PA进入细胞,能够剧烈升高细胞内cAMP水平,影响机体相关信号转导。以往对炭疽毒素的研究主要集中于LT,而对ET在炭疽感染和死亡中发挥的作用还不是十分了解。炭疽芽孢可以通过呼吸道、皮肤或消化道感染宿主。通过呼吸道进入体内的炭疽芽孢在被肺泡巨噬细胞吞噬后进入局部淋巴结,并萌发成繁殖体细菌。而在局部组织中萌发的炭疽芽孢,也能够利用炭疽毒素破坏天然免疫屏障而进入到局部淋巴结。巨噬细胞是天然免疫系统的关键成员之一,本研究针对ET对巨噬细胞功能的抑制作用及其分子机制进行了研究。首先在大肠杆菌中表达并纯化野生型炭疽水肿因子EF,及腺苷环化酶活性关键氨基酸残基突变的EF(H351R)和EF(H351A)。在体外非细胞反应体系和CHO-k1细胞中,野生型EF表现出极高cAMP生成效率,而EF(H351R)和EF(H351A)催化产生c AMP的效率大幅降低但仍有残留。在小鼠实验中,野生型或突变体EF与PA构成的ET、ET(H351R)和ET(H351A)能造成不同程度的器官损伤和局部水肿,损伤严重程度与组织内cAMP水平正相关。25-50μg的野生型ET可以造成小鼠死亡,而相同剂量的ET(H351R)或ET(H351A)对小鼠没有致死性。以小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7作为细胞模型,对ET的作用效果进行评价。单核细胞成熟后可以分化成组织驻留表型和炎性表型两种不同的亚群。通过流式细胞术检测RAW264.7表面分子标志显示,在未经处理或LPS单独处理时细胞呈现CD14~+CD16/32~+的组织驻留表型,而ET与LPS共同刺激后这些细胞转变为CD14~(hi)CD16/32~-的表型。表达GFP蛋白的大肠杆菌能够被巨噬细胞吞噬,通过流式细胞术检测巨噬细胞的GFP阳性率及每个细胞中GFP荧光强度,能够反映巨噬细胞的吞噬功能和杀菌功能。结果显示,经ET预处理3h后的巨噬细胞吞噬功能没有下降,但是对胞内细菌的杀伤功能明显减弱。而对巨噬细胞分泌的细胞因子检测表明,ET处理下调了促炎细胞因子TNF-α和MCP-1的产生而上调了抑炎细胞因子IL-10和IL-6的产生。这些现象提示,ET处理使RAW264.7细胞向M2型分化。进一步利用新一代测序技术,对ET、ET(H351A)、腺苷酸环化酶激动剂Forskolin或PA处理后的RAW264.7细胞转录组进行了分析。相比PA处理组,ET、ET(H351A)和Forskolin处理分别使RAW264.7细胞产生了1228个、264个和211个基因表达上调或下调。对细胞内cAMP水平检测的结果显示cAMP水平升高与转录组差异程度具有正相关。从ET处理产生的差异基因筛选到了27个cAMP依赖基因,这些基因的功能主要与巨噬细胞免疫反应有关,而剩余的非cAMP依赖基因则主要参与细胞物质、能量代谢等功能。通过KEGG信号通路聚类分析ET处理产生的差异基因,发现TNF-α经过MAPK和NF-kB信号介导巨噬细胞活化这一途径中有较多差异基因富集。通过western-blot检测发现,ET处理抑制了MAPK蛋白家族成员ERK的磷酸化活化。而ET和ERK磷酸化抑制剂PD3125901处理RAW264.7细胞均能抑制细胞中TNF-α的转录活化与分泌。这提示,ET下调巨噬细胞TNF-α产生可能与ERK磷酸化抑制有关。ET处理还能抑制NF-kB结合位报告基因的活化以及下调TNF-α对NF-kB的激活。NF-kB抑制剂BAY 11-7082也能下调TNF-α基因启动子的活化。p65是最重要的NF-kB亚基。ET处理抑制了p65的磷酸化,减少了p65在细胞核中的定位。cAMP主要通过活化PKA发挥其活性。PKA抑制剂H89能够逆转ET对NF-kB转录活性的抑制。这些结果表明,ET可能通过PKA途径抑制p65介导的TNF-α转录活化。以上结果表明,ET可以通过抑制ERK和NF-kB活化,减少巨噬细胞的TNF-α产生。综上所述,本研究制备了野生型EF及其腺苷酸环化酶活性减弱的突变体EF(H351A)和EF(H351R),发现了ET对于巨噬细胞表面分子标记改变和促炎功能的抑制;通过转录组测序,揭示了ET对巨噬细胞免疫功能的调控主要与其腺苷酸环化酶活性相关;进一步的分子机制研究表明,ET可能通过PKA途径抑制ERK和NF-kB活化,从而下调了巨噬细胞炎性因子TNF-α的产生。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378
【图文】：

炭疽,局部淋巴结,特洛伊木马,菌血症

图 1 炭疽毒素作用模式图[9]Figure1. Mode of action of anthrax toxins在炭疽感染中的作用根据炭疽芽孢进入宿主机体的途径，炭疽病有三种形式：皮肤、胃肠道炭疽（图 2）。早期研究表明定殖的巨噬细胞和树突细胞将炭疽芽孢吞特洛伊木马”一样将芽孢从外周部位带到局部淋巴结。炭疽芽孢在局部淋成能产生毒素的细菌繁殖体[10]。近年来，有实验证明炭疽芽孢也能在鼻组织、肠相关淋巴组织或损伤的表皮软组织中萌发，并开始产生毒力因素和蛋白酶。这些毒力因子能够降低机体的免疫反应和增加组织通透性菌繁殖体进入到局部淋巴结，这种感染模式被称为“越狱模型”[11]。一旦结被炭疽毒素“攻破”，炭疽芽孢杆菌便能够随血液循环，引起菌血症，宿主死亡。

宿主,髓系细胞,炭疽芽孢杆菌,小鼠

图 2 炭疽芽孢通过三种途径进入宿主[12]Figure 2.B. anthracis enters the host as a spore through threealternative ports对小鼠皮下注射重组表达的 ET 能造成严重的皮肤水肿，而全身攻毒则引起消化道液体聚集、肝水肿、严重组织损伤以及死亡[13,14]。对于小鼠，ET 的最低致死剂量是 20 30 μg，低于 LT 对小鼠的最低致死剂量（40 100 μg），这表明在炭疽芽孢杆菌致病过程中 ET 也发挥着重要的作用。除了在炭疽感染末期造成直接组织损伤以及引起死亡，ET 在炭疽感染初期能够干扰宿主天然免疫反应，促进了全身感染的形成（图 3）。在髓系细胞中特异性敲除 CMG2 的小鼠能够耐受 Sterne 株炭疽芽孢及细菌繁殖体的攻毒，而野生型小鼠对这个菌株的攻毒高度敏感；另外，这些髓系细胞特异性敲除 CMG2 的小鼠对 LT 和 ET 攻毒的敏感性没有下降[15]，表明炭疽毒素对炭疽芽孢杆菌躲避髓系细胞的清除作用至关重要。敲除 EF 基因的炭疽芽孢杆菌 Sterne 株感染力下降

阿米巴,信使,免疫功能,生物效应

第 5 页图 3 炭疽毒素对巨噬细胞作用[12]Figure3. Effects of the anthrax toxins on macrophages作用的分子机制ET 的主要活性是将 ATP 转化为 cAMP，cAMP 是一种在细胞内广泛存在的信使，其浓度改变能够引发复杂的生物效应。但是我们对 ET 引发的机体损 cAMP 水平升高之间的具体机制还不是十分了解。cAMP 是二级信使家族最早的成员，大量研究表明，cAMP 对包括阿米巴虫、和哺乳动物等多种生物的细胞功有调控作用[24]。这个二级信使分子介导的生程包括记忆、代谢、记忆调控和免疫功能[25]。细胞内的 cAMP 水平受到磷酸酶（phosphodiesterase，PDE）的严格调控，PDE 通过水解 cAMP 拮抗其信细胞内的 AC 与 PDE 通常定位于不同的空间结构，因而 cAMP 的产生与消

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