Tk3在日本血吸虫生殖发育中的功能研究

发布时间：2020-08-15 13:14

【摘要】：目的:血吸虫病是全球最常见的人兽共患病之一,血吸虫卵为血吸虫致病和流行的最关健因子,因此,掌握血吸虫生殖发育与产卵的生物学分子机制,发现可供干预的关键靶点,对于制定预防和治疗这些感染的新策略至关重要。TK3是细胞酪氨酸激酶家族的成员,曼氏血吸虫Sm TK3主要定位于血吸虫雌虫的卵黄腺和卵母细胞以及雄虫的精原细胞中,推测其可能参与曼氏血吸虫的生殖活动,然而日本血吸虫TK3在其生殖过程中的作用却尚不明确。本研究的目的是探讨TK3在日本血吸虫生殖发育中的作用。方法:根据SmTK3设计引物,以日本血吸虫cDNA为模板,扩增获得日本血吸虫Sj TK3全长序列。用DNAMAN软件分析其氨基酸序列,了解Sj TK3蛋白在各个物种中的同源,利用MEGA5软件建立了Sj TK3详细的系统进化树。使用TRIzol方法提取虫体总RNA,用荧光定量PCR的方法分别检测日本血吸虫虫卵、尾蚴、童虫期、24天雄虫和雌虫以及42天雄虫和雌虫Sj TK3的表达情况。Dihydrochloride是一种Src激酶抑制剂,在体外应用于日本血吸虫。Dihydrochloride处理日本血吸虫7天后,收集血吸虫虫体和虫卵,观察不同处理量的实验组与空白组虫卵的数量变化;同时利用共聚焦激光扫描显微镜下拍摄血吸虫生殖器官形态图片并分析。最后使用q PCR分析了一些与虫卵形成相关基因的变化情况。结果:利用PCR扩增出Sj TK3基因全长,经测序和初步分析该基因共编码647个氨基酸。用TK3所在几个代表物种构建进化树,通过对进化树的观察,日本血吸虫此基因与其他物种TK3基因并为一条进化支,因此确认日本血吸虫TK3基因属于Src家族成员,通过DNAMAN软件分析TK3蛋白同源性,发现日本血吸虫TK3蛋白与曼氏血吸虫TK3蛋白(即Sj TK3和Sm TK3)同源性很高,为91.6%,故将其命名为日本血吸虫Sj TK3。Sj TK3 m RNA在日本血吸虫的生活史各个阶段中呈现差异表达。在Src抑制剂Dihydrochloride处理后,激光共聚焦显微镜的观察结果显示,在日本血吸虫的生殖器官,尤其是在雌虫的卵巢和雄虫的睾丸,其生殖细胞形态有所改变,可观察到孔状结构;随Dihydrochloride处理的浓度上升,分别加入25μM,50μM,75μM的量,在处理第7天时用普通光学显微镜计数虫卵数量,发现雌虫产卵数量在50μM,75μM浓度处理下各下降了约18%和31%,此外,在Dihydrochloride处理后第7天,一些重要的虫卵形成相关基因(P14,P48和Fs800)的表达水平也发生了变化。结论:根据本实验我们推断,Sj TK3在日本血吸虫生殖器官的成熟和虫卵的发育和产生中发挥相当重要的功能。这些发现有助于我们更好地了解日本血吸虫的生殖生物学,发现调控日本血吸虫生殖发育信号通路中的重要分子,通过干预其关键靶点从而有效抑制血吸虫生殖发育,可实现对血吸虫致病和流行进行有效的控制。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R383.24

【参考文献】