参与容积调控阴离子通道激活的磷脂酶C亚型的筛选

发布时间：2020-08-17 20:45

【摘要】：容积调控阴离子通道(Volume Regulated Anion Channel,VRAC)是一种在细胞体积扩大时被激活的阴离子通道。VRAC在人体组织中表达广泛并具有重要的生理功能。当细胞体积扩大时,VRAC被激活并产生称为细胞调节性容积减小(regulatory volume decrease,RVD)的过程来实现对细胞体积的保护。VRAC与细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡和肥胖等一系列病理、生理过程密切相关。近年来,已经有两个实验室分别发现LRRC8A的同源异聚体是VRAC的分子基础,但其激活机制尚不清楚。有文献表明,细胞内钙可能参与VRAC的激活,本实验室前期研究结果也证实,当细胞内局部钙浓度改变时会影响VRAC的激活。而细胞发生肿胀时伴随着细胞内钙浓度的上升。我们知道细胞内的磷脂酶C(PLC)信号通路的激活会诱发细胞内钙的的释放和细胞内钙浓度的上升。由此我们推测PLC通路可能参与VRAC的激活。本课题专注于PLC通路对VRAC激活的影响。实验分为两部分:第一部分主要建立了YFP-HEK293A稳转细胞系,以及使用激光共聚焦、电生理膜片钳和FLIPR等技术对该稳转细胞系的可靠性进行验证,作为接下来评价PLC亚型对VRAC激活影响的实验的基础;第二部分主要借助FLIPR系统和YFP-H293A稳转细胞系进行高通量筛选(high throughout screening,HTS)实验来观察使用si RNA沉默不同PLC亚型对VRAC功能的影响,接着使用电生理膜片钳和qPCR的方法来进一步验证上述结果,以探索不同PLC亚型对VRAC激活的贡献。第一部分:YFP-HEK293A稳转细胞系及VRAC功能检测平台的建立。目的:获得对卤素离子敏感的YFP-HEK293A稳转细胞系,并使用包括HTS平台在内的方法检测稳转细胞系中VRAC的功能来验证稳转细胞系。方法:1搭建YFP-H148Q-I152L质粒并瞬时转染进入空白HEK293A细胞。获得表达YFP的HEK293A细胞。2使用灭瘟素处理HEK293A细胞,获得死亡曲线,确定最小致死浓度为15μg/mL;将YFP-H148Q-I152L瞬时转染进HEK293A细胞,使用无限稀释法获得单个细胞;使用含有15μg/mL灭瘟素的培养基继续培养获得YFP-HEK293A稳转细胞。3使用激光共聚焦、FLIPR和电生理膜片钳等方法验证建立的YFP-HEK293A稳转细胞系的功能。结果:1.建立的YFP-HEK293稳转细胞系在共聚焦488 nm光源下可激发荧光,在不同批次(N=7)的实验中,YFP阳性的细胞比率在90.46%±8.34(N=7);而瞬时转染YFP时YFP阳性细胞的比率为23.67%±11.56(N=6)。另外,细胞处于低渗条件时(激活VRAC)加入NaI溶液,两种转染类型的细胞荧光强度均下降(进入细胞的I~-对荧光的淬灭),且10μM的DCPIB(VRAC阻断剂)能显著阻断这一荧光降低过程。2.电生理实验中,在VRAC被低渗外液激活的条件下,稳转细胞系在-60 mV钳制电压下的电流密度为118.71±14.56 pA/pF(n=9);空白HEK293A的电流密度为103.24±11.38 pA/pF(n=13);两者无显著性差异,表明YFP的表达并不影响VRAC电流密度。且两者在低渗条件下诱导的VRAC电流,均能被10μM的DCPIB抑制。3.在FLIPR的高通量荧光检测实验中,在低渗及I~-存在的条件下,稳转细胞系和瞬时转染YFP的细胞荧光强度降低百分比分别为90.68%±4.92(n=34)和92.13%±3.35(n=25),两者无显著性差异。在7μM的U73122(PLC阻断剂)和10μM的DCPIB存在的情况下,由低渗及I~-诱发的稳转细胞系的荧光强度降低由原来的93.34%±5.45(n=12)分别降低为54.43%±7.68(n=21,*P0.05)和25.61%±3.93(n=18,**P0.01)。结论:激光共聚焦、膜片钳和FLIPR高通量荧光检测实验结果表明:建立的YFP-HEK293荧光蛋白稳转细胞系并不影响HEK293细胞内在的VRAC特性,其表现出与空白HEK293A类似的VRAC特性:在低渗细胞外液条件下5 min左右VRAC完全开放,且可被VRAC阻断剂DCPIB阻断,稳转细胞系成功建立;FLIPR高通量荧光检测系统可以检测VRAC的开放。第二部分:磷脂酶C亚型在VRAC激活中的作用。目的:利用基因沉默的方法来评价细胞内不同PLC亚型对VRAC激活的影响,利用qPCR的方法确定si RNA的敲除效率。方法:1将靶向不同PLC亚型的siRNA瞬时转染进入YFP-HEK293A稳转细胞系,降低相应PLC亚型的表达。2使用q PCR技术,检测各个PLC亚型的敲除效率。3使用FLIPR仪器进行高通量荧光检测实验,通过对荧光强度的检测寻找可影响VRAC功能的PLC亚型。4进行电生理膜片钳实验来进一步验证高通量荧光检测实验的结果。结果:1.PLC阻断剂U73122在膜片钳、FLIPR和激光共聚焦实验中均能显著抑制VRAC通道激活,表明PLC可能参与了VRAC的激活2.qPCR的结果显示,利用相应siRNA干扰PLCβ3、PLCβ1、PLCζ1、PLCδ4、PLCδ3、PLCβ4、PLCγ1、PLCλ2、PLCη1和PLCχδ1等10种亚型后,PLC亚型表达分别降低54.12%、61.26%、67.86%、57.21%、51.43%、59.56%、49.67%、71.24%、65.67%和55.12%。3.在FLIPR的高通量荧光检测实验中发现,低渗诱导的空白对照组荧光强度均显著降低,与低渗诱导的空白对照组87.63%±8.54(n=48)相比,敲低PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ27种亚型后低渗及NaI诱导的荧光强度降低分别为37.66%±4.68(n=18,*P0.05)、38.12%±6.89(n=18,*P0.05)、51.68%±9.56(n=17,*P0.05)、33.57%±5.46(n=17,**P0.01)、22.51%±4.65(n=18,*P0.05)、41.78%±11.54(n=12,*P0.05)和44.51%±8.86(n=17,*P0.05),VRAC的激活受到不同程度影响;而敲低PLCβ4、PLCη1、PLCζ1、PLCε1、PLCχδ2、PLCβ2、PLCη2和PLCλ1后低渗及NaI诱导的荧光强度降低分别为84.78%±11.23(n=17)、80.24%±13.45(n=18)、80.6%±13.53(n=12)、81.33%±11.35(n=18)、86.74%±9.69(n=12)、81.67±9.79(n=17)和84.33%±11.43(n=12),与空白对照组均无差异。4.在膜片钳实验中,在敲低PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ2等PLC亚型的稳转细胞系上进行膜片钳实验发现,相比于空白对照组低渗细胞外液条件诱发的VRAC电流密度明显减小,分别为22.54±4.32 pA/pF(n=13,*P0.05)、29.68±5.62 pA/pF(n=12,**P0.01)、27.24±6.23 pA/pF(n=14,**P0.01)、35.27±8.62 pA/pF(n=13,*P0.05)、21.65±3.38 pA/pF(n=17,***P0.001)、20.35±7.24 pA/pF(n=13,**P0.01)和32.47±7.64 p A/p F(n=11,**P0.01),而低渗诱导的空白对照组、使用含有无效序列siRNA处理的阴性对照组(scramble siRNA组)、PLCζ1、PLCβ4和PLCη1组细胞电流密度分别为128.65±21.34 pA/pF(n=11)、145.32±17.88 pA/pF(n=7)、132.92±28.75pA/pF(n=9)、113.93±19.85 pA/pF(n=8)、98.49±19.75 p A/p F(n=9)。结论:PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ2等七种PLC亚型可能参与了VRAC的激活。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363

【参考文献】