【摘要】：缺血后处理(Ischemic postconditioning, IPO)是指在器官缺血发生后,长时间的再灌注之前,对器官进行数次短暂的再灌注/缺血循环的处理方法,它是一种新的机械性干预方法。与缺血预处理(Ischemic preconditioning, IPC)一样,大量的研究证实IPO可以减轻不同种属的不同动物的心肌再灌损伤。有关于IPO对肾脏缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)作用的研究不多,且都集中于小动物。本研究拟评价肾脏IPO对犬肾I/R损伤的保护效果并探讨IPO的可能机制以及IPO对再灌注损伤引起的鼠肾小管纤维化的作用。 第一部分缺血后处理对犬肾缺血再灌注损伤的保护作用研究 目的：探讨缺血后处理是否对犬肾缺血再灌注损伤具有保护作用 方法：随机将成年雄性犬分为假手术(Sham)组、I/R组和15秒、30秒和1分钟三种IPO组,每组6只。Sham组：犬用3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉后,经腹部正中切口进入腹腔,游离双侧肾脏,切除右肾后,关闭腹腔。I/R组：前面部分手术操作与sham组相同,在切除右肾和游离左肾之后,将左肾动、静脉夹闭60min,然后开放血管。三种IPO组：手术操作与I/R组相同,仅在夹闭肾动、静脉60min后,再以灌注(开放血管)15s、夹闭血管15s为1个循环,共进行6次循环,然后完全放开血管；再灌注(开放血管)30s、夹闭血管30s为1个循环,共进行6次循环,然后完全放开血管；再灌注(开放血管)1min、夹闭血管1min为1个循环,共进行3次循环,然后完全放开血管。术毕留置导尿管并将尿袋放置于自制犬衣,收集24h尿量。分别于术后24h、48h及72 h采集犬静脉血2ml,使用全自动生化分析仪测定各组犬血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平。测定尿N—乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)含量并计算尿NAG/Cr以及内生肌酐清除率(Ccr)值,术后72h取左肾组织,电镜以及光镜下观察肾组织结构变化。 结果：与Sham组相比,再灌注24h、48h、72 h后各处理组血清Cr和BUN,尿NAG/Cr均显著增高(P0.05),以I/R组增高最为明显(P0.01),I/R组术后第三天Cr和BUN达到最高峰。而三种IPO组的Cr和BUN, NAG/Cr又明显低于I/R组(P0.05)。三种IPO之间比较,15s IPO组的Cr和BUN较后两者低,差异有统计学意义(P0.05)。与Sham组相比,再灌注24h时各处理组Ccr均降低,以I/R组降低最为明显(P0.05)。各组再灌注48h、72h时Ccr均开始升高,仍低于术前(P0.05)。而IPO组的Ccr又高于I/R组(P0.05)。三种IPO组之间比较,15s组的Ccr较后两者高,差异有统计学意义(P0.05)。Sham组肾小管结构正常,未见明显病理改变；I/R组肾间质水肿,大量炎症细胞浸润,可见上皮细胞的刷状缘消失,伴有部分上皮细胞坏死、脱落,管腔扩张明显,其中可见大量管型以及空泡形成；IPO组可见肾间质呈轻度水肿,肾小管的上皮细胞变扁平,肾小管上皮细胞坏死以及管型少见,管周血管可见有少量淤血。电镜下观察I/R组肾小管上皮细胞内线粒体肿胀,部分嵴消失,微绒毛消失,空泡形成。 结论：IPO可以减轻犬肾脏缺血再灌注损伤,三种IPO组中15s IPO组减轻缺血再灌注后肾损伤,保护肾功能的作用最强。 第二部分缺血后处理减轻犬肾缺血再灌注损伤的相关机制 目的：探讨缺血后处理减轻犬肾缺血再灌注损伤的相关机制 方法：随机将犬分为Sham组、I/R组和15s、30s和1min三种IPO组,每组5只。Sham组：犬麻醉后,经腹正中切口进入腹腔,游离双侧肾脏,切除右肾后关闭腹腔。I/R组：前面部分手术操作与Sham组相同,在切除右肾和游离左肾之后,将左肾动、静脉夹闭60min,然后开放血管。三种IPO组：手术操作与I/R组相同,仅在肾动、静脉被夹闭60min后,以再灌注(开放血管)15s、夹闭血管15s为1个循环,共进行6次循环,然后完全放开血管；再灌注(开放血管)30s、夹闭血管30s为1个循环,共进行6次循环,然后完全放开血管；再灌注(开放血管)1min、夹闭血管1min为1个循环,共进行3次循环,然后完全放开血管。术后第三天麻醉下取犬左肾组织,采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量以及采用化学比色法测定髓过氧化物酶(MPO)活性,TUNEL法观察犬肾组织肾小管上皮细胞凋亡。 结果：与Sham组相比,I/R组和IPO肾组织SOD值均下降,MDA, MPO以及肾小管上皮细胞凋亡增加(P0.05)。与I/R组比较,IPO肾组织SOD增加,MDA, MPO以及肾小管上皮细胞凋亡下降(P0.05)。 结论：IPO对犬肾缺血再灌注的保护作用与减少氧化应激、炎性细胞浸润以及减少凋亡有关。IPO可能通过清除活性氧,抑制脂质过氧化,提高肾组织的抗氧化能力,减少中心粒细胞的集聚及凋亡而起作用。 第三部分缺血后处理对鼠肾缺血再灌注后远期纤维化的影响 目的：观察大鼠缺血再灌注损伤的远期改变以及缺血后处理对其影响 方法：随机将SD大鼠分为Sham组、I/R组和15s×6次循环IPO组,每组12只。Sham组：戊巴比妥钠麻醉鼠后取其腹正中切口进入腹腔,游离并暴露双侧肾脏,切除右肾后,关腹。I/R组：同样麻醉并显露双侧肾脏,切除右肾后,将左肾动、静脉夹闭45min,然后开放血管。IPO组：手术操作与缺血再灌注组相同,仅在肾动、静脉被夹闭45min后,用无创血管夹开放血管15s、夹闭血管15s为1个循环,共进行6次循环,然后完全放开血管。观察时间为缺血后2周和8周。每组每个时间点n=6。测定2周后血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)浓度。分别于2周及8周后HE和Masson染色观察肾组织病理变化,免疫组织化学(IHC)和(?)Vesternblot检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子(TGF-β1)、和信号传导蛋白(Smad-2)在肾组织的表达和分布。 结果：与Sham组相比,再灌注2周后各组血清Cr和BUN已经恢复正常(P0.05)。IPO组引起的肾小管间质损伤已基本恢复正常,组织形态学接近于假手术处理组,而I/R组却仍有小管变形,空泡,炎性细胞浸润等病理改变。Masson染色小管间质已经有纤维化趋势。再灌注8周HE染色I/R组皮质以及外髓质部分肾小管上皮细胞肿胀变性,少量炎性细胞浸润,三组间结果差异无显著性(P0.05)。IHC显示α-SMA、TGF-β1在I/R组肾脏表达较强,而在IPO组表达减弱。(?)Vesternblot的结果显示：IPO组的α-SMA、TGF-β1和Smad-2表达高于Sham组,但是都低于其在I/R组的表达。 结论：肾脏缺血再灌注损伤不仅可以导致肾脏近期损伤,还对肾脏远期功能有影响,可以导致肾小管间质纤维化。IPO可以减轻这种纤维化,其机制可能与降低α-SMA、TGF-β1和Smad-2在肾组织的表达有关。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363
【共引文献】
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本文编号：2796804
