糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白对骨生成的作用

发布时间：2020-08-19 14:47

【摘要】：糖皮质激素(glucocorticoids, GC)不仅有导致骨质疏松的骨分解,还有促骨生成作用。然而目前尚不清楚什么因子介导GC的促骨生成作用。糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白(glucocorticoid-induced leucine zipper, GILZ)是GC诱导的一种抗炎介导因子。在本研究中,我们通过构建骨特异性GILZ过表达Tg鼠,证实GILZ具有促进在体骨生成的作用。我们首先构建GILZ-HA真核表达载体(Col3.6-GILZ-HA),其编码基因由片段长度为3.6kb的I型胶原启动子(Co13.6)驱动。我们委托生物技术公司将目的基因植入C57BL/6小鼠基因组。在获得原代转基因鼠(Tg)后,我们繁育了三个独立的鼠系,并根据它们的基因拷贝数和目的基因在骨组织中的表达,筛选出最优鼠系。该系Tg鼠骨组织GILZ表达明显升高,与GC诱导的内源性GILZ升高水平接近。Tg鼠在身长、体重、采食、行为、繁殖能力等方面与同窝对照鼠(WT,外源基因阴性)均无明显差异。 Tg鼠系建立以后,我们首先采用骨密度分析仪对3月龄鼠进行分析。结果显示,与WT相比,Tg骨密度(BMD)和骨含量(BMC)均出现明显升高,其中雄性BMD和BMC分别显著增加12%和24%(p0.05),雌性BMD和BMC分别显著增加12%和16%(p0.05)。显微CT扫描图像三维重建发现,与同窝WT相比,3月龄Tg鼠股骨远端骨体积(BV/TV)增加28%(p0.05)；骨小梁数量(Tb.N)显著增加15%(p0.05)；骨小梁直径(Tb.Th)显著增加13%(p0.05)；骨小梁间隙(Tb.Sp)、连接系数(Conn. D)和结构指数(SMI)无明显差异(p0.05)。至6月龄,二者差异进一步加大,Tg鼠BV/TV较WT增加73%；Tb.N增加53%;Tb.Th增加15%；Tb.Sp减少41%；Conn. D增加150%；SMI减少22%,差异均具有显著性(p0.05)。骨量增加既可能是骨生成增加的结果,也可能是骨重吸收减少的结果。为确定Tg鼠骨生成是否增加,我们采用了钙绿素双标实验观察3月龄股骨的骨生成变化。结果证实,Tg骨生成确实大幅度增加,其中：骨矿化率(mineral apposition rate, MAR)较WT增加2倍；矿化面积(MS/BS)增加26%；骨生成率(bone formation rate, BFR)增加2.5倍。骨脱钙切片组织形态学观察发现,Tg骨小梁上附着的成骨细胞(Osteoblasts,Ob)显著增多。与WT相比,Tg在骨小梁上Ob密度(N.Ob/B.Pm)增加93%(p0.05)；成骨细胞面积(Ob.S/BS)增加46.7%。此外我们还观察到Tg骨髓腔中,脂肪细胞有一定程度的减少。为了证明Ob数量增加是骨髓干细胞成骨分化增强,成脂肪分化减弱的结果,我们进行了骨髓集落生成单位(colony formation unit, CFU)分析。新鲜骨髓稀释成单细胞悬液,以极低密度接种。给予常规培养液,或成骨诱导培养液,或成脂肪诱导培养液处理,在固定时间点分别固定细胞,给予Giemsa染色,以分析成纤维细胞集落(CFU-F);或油红染色,以分析成脂肪细胞集落(CFU-Ad),或孵育碱性磷酸酶(ALP)底物,以分析成骨细胞集落(CFU-Ob)。 CFU-F分析显示Tg与WT无显著差异,说明骨髓干细胞数量无明显变化。而CFU-Ob显示,Tg显著高于WT；而CFU-Ad相反,Tg显著低于WT。这说明Tg骨髓细胞中,骨分化潜能的细胞比例增多。与之相对应,脂肪分化潜能细胞减少。为了在基因水平检验GILZ过表达对骨髓细胞的影响,我们采用实时定量Rt-PCR,分析体外培养原代骨髓细胞的转录因子水平变化,发现在Tg骨髓细胞中,两种关键性成骨调控因子,Runx2和Osx的基础mRNA水平较WT分别增加2.4倍和4.7倍(p0.05)；而成脂肪调控因子PPARγ2则显著下降,为WT水平的67.5%(p0.05)。经过6天的成骨培养液诱导,WT和Tg骨髓细胞的Runx2和Osx均上升。相比之下,WT上升幅度更大。Runx2的mRNA水平Tg仅为WT的1.2倍,差异不再显著(p0.05),而Osx的mRNA水平Tg仍然高于显著WT,是其2.7倍(p0.05)。PPARγ2的mRNA水平Tg与WT差距进一步加大,降至WT的1%。上述结果说明GILZ改变了骨髓细胞中调控因子的表达,增加成骨凋控因子,降低成脂肪调控因子,使更多细胞倾向于成骨,而非成脂肪分化。 PPARγ2是控制骨髓干细胞成脂肪分化的关键因子。PPARγ2的表达需要C/EBPs蛋白参与。为进一步明确GILZ与C/EBPs的相互作用。我们进行了一系列蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用的研究。免疫共沉淀实验和GST-pull down实验均证实,发现,HA-GILZ可以与Flag-C/EBP蛋白一起被anti-Flag抗体所共沉淀。GILZ可与C/EBP蛋白牢固结合。在凝胶迁移(EMSA)实验发现,GILZ并不影响GST-C/EBPP与DNA结合的活性。相反,GILZ可以与C/EBPP共同结合DNA,形成蛋白-蛋白-DNA复合物,使C/EBPP与DNA结合增强。在DNA-pull down进一步证实在细胞内,GILZ、C/EBPβ与DNA之间可以形成特异性的蛋白-蛋白-DNA复合物。GILZ可能与C/EBP形成异源二聚体,共同转移至胞核并结合于结合位点。但GILZ-C/EBP二聚体不能激活下游PPARγ2勺表达,相反还使其表达受抑制。结论：GILZ具有促骨生成作用。在体环境下,GILZ可使Ob数量增多,骨组织体积增大,骨结构改善,骨质量和矿物质沉积增加。GILZ的促骨生成机制包括：抑制成脂肪调控因子PPARγ表达；增加成骨调控因子Runx2、Osx等表达；刺激MSCs的成骨分化,抑制成脂肪分化。GILZ可能是迄今为止第一种被发现的GC诱导的促骨生成介导因子。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R336
【图文】：

Ir.L.Th测量示意

基因拷贝,基因修饰,鼠尾

图1.候选建系鼠基因拷贝检测准DNA。无基因修饰背景的C57/B6鼠尾DNA中渗入不同拷贝的pCol3.6-GILZ-H的PCR扩增产物（496 bp)与拷贝数呈正比。泳道7:对照（WT) DNA,目的基-10:原代Tg鼠DNA。其目的基因扩增产物与标准DNA进行对比，口了得知其基因a b

表型,基因拷贝,基因修饰,鼠尾

Standard DMA x ^1x 2x 4x 8x 16x 32xbp Col3.5'GILZt)P Glucagon1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图1.候选建系鼠基因拷贝检测1-6:标准DNA。无基因修饰背景的C57/B6鼠尾DNA中渗入不同拷贝的pCol3.6-GILZ-HA质粒。基因的PCR扩增产物（496 bp)与拷贝数呈正比。泳道7:对照（WT) DNA,目的基因为阴泳道8-10:原代Tg鼠DNA。其目的基因扩增产物与标准DNA进行对比，口了得知其基因拷贝数。

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