人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白诱导小鼠巨噬细胞自噬清除细胞内分支杆菌M.aurum

发布时间：2020-08-20 13:17

【摘要】：结核分支杆菌引发的结核病仍然是威胁世界人民健康,制约经济发展的重大传染病。多药耐药分支杆菌的出现以及艾滋病感染患者增加使得形势更加严峻,因此,当前迫切需要研发更高效的抗菌药物替代传统抗生素。嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(Eosinophil cationic protein,ECP),又名RNase3,属于人核糖核酸酶A家族的成员,除具有催化单链核糖核酸作用还发现其同时具有抗菌作用,在机体的先天免疫反应中扮演重要角色。目的:本文旨在研究ECP的抗分支杆菌作用及其相关机制。方法:1)胞外水平检测ECP对快速生长且不致病型的M.aurum分枝杆菌的生长抑制和细胞沉聚作用,即测定ECP对M.aurum的最小100%抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC_(100)),与此同时,构建小鼠巨噬细胞RAW264.7感染M.aurum的体外模型并以此模型检测ECP对细胞内M.aurum的作用并与细胞外试验对比;其次,通过实时荧光定量PCR检测两个参与自噬重要过程的BECN1和ATG5基因的转录表达水平,同时采用蛋白免疫印迹和免疫荧光检测另一个自噬相关蛋白LC3,验证ECP是否能诱导巨噬细胞自噬;最后,对比添加自噬诱导剂Rapamycin或自噬抑制剂Bafilomycin A和3MA条件下ECP在胞内抗菌效果。结果:ECP能有效抑制M.aurum的生长,体外MIC_(100)低至5 uM;胞内MIC_(100)为2 uM,该浓度对小鼠巨噬细胞无细胞毒性。相较于对照组,0.75 uM(细胞内的MIC_(100),2 uM)的ECP处理24 h后自噬基因BECN1和ATG5的转录水平表达显著上调,与qPCR结果一致,蛋白免疫印迹证实ECP能提高LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ。自噬诱导剂Rapamycin能提高ECP(0.75 uM)对巨噬细胞内M.aurum的抑制作用,与此同时自噬抑制剂Bafilomycin A和3MA均能抑制ECP的作用。结论:ECP在细胞内外均能有效抑制M.aurum,除通过破坏分支杆菌细胞壁发挥抑菌作用,其还能诱导巨噬细胞的自噬作用,进一步清除细胞内的分支杆菌。
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.911

【参考文献】