慢病毒介导的PTPRR基因过表达和沉默小鼠模型与抑郁发生的关系研究

发布时间：2020-08-23 11:37

【摘要】：目的:通过体外包装高滴度PTPRR基因过表达和PTPRRsh RNA慢病毒颗粒,将病毒颗粒经小鼠脑立体定位术注入小鼠海马区,构造PTPRR基因过表达和沉默小鼠模型,比较基因过表达及基因沉默小鼠在悬尾实验、糖水实验、强迫游泳实验中抑郁相关的行为变化,进一步联合慢性不可预知刺激(CMS)方法观察小鼠抑郁行为的改变,初步探讨动物模型中PTPRR基因与抑郁发生的关系。方法:1.首先将已构建成功的PTPRR基因过表达载体及空白对照载体GFP、PTPRRsh RNA载体及空白对照载体sh GFP,转染至293T细胞进行包装,浓缩产生适用于体外实验的高滴度病毒颗粒。2.采用脑立体定位技术在小鼠海马区微量注射慢病毒颗粒,从而引起小鼠海马区PTPRR基因过表达及基因沉默,实验28天后取新鲜海马组织,采用Western-blot、RT-PCR的方法分别检测小鼠海马区PTPRR蛋白及PTPRRm RNA表达改变。3.80只C57BL/6J小鼠随机分为10组,每组8只,分别为:①Lenti-sh PTPRR(PTPRR基因沉默)组;②lenti-sh GFP(低表达空载体)组;③Lenti-PTPRR(PTPRR基因过表达)组;④lenti-GFP(高表达空载体)组;⑤control(正常对照)组;⑥Lenti-sh PTPRR+CMS(PTPRR基因沉默干预)组;⑦lenti-sh GFP+CMS(空载体干预)组;⑧Lenti-PTPRR+CMS(PTPRR基因过表达干预)组;⑨lenti-GFP+CMS(高表达空载体干预)组;⑩control+CMS(正常对照干预)组。小鼠术后1周,第⑥-⑩组进行CMS干预21天后,观察比较各组小鼠抑郁行为的变化。结果:1.成功建立具有特异性的PTPRR高表达及PTPRRsh RNA病毒包装颗粒,病毒滴度达到1x109TU。2.注射病毒28天后发现,Lenti-PTPRR组小鼠海马组织PTPRRm RNA及蛋白水平与control组和Lenti-GFP组明显增高(P0.001);Lenti-PTPRRsh RNA组小鼠海马组织PTPRRm RNA及蛋白水平较control组和Lenti-sh GFP组明显降低(P0.001);而Lenti-GFP组与control组两组间比较,Lenti-sh GFP组与control组两组间比较,PTPRRm RNA及蛋白水平无显著性差异(P0.05)。3.在强迫游泳实中,各组间不动时间具有显著差异(F=28.823),Lenti-GFP组和control组两组间T检验无显著性差异;Lenti-sh GFP组和control组两组间T检验无显著性差异(P0.05);Lenti-PTPRR组分别与Lenti-GFP组进行T检验,小鼠不动时间明显延长(p0.05);Lenti-sh PTPRR组与Lenti-sh GFP进行T检验,强迫游泳不动时间无显著性改变(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS组与control+CMS组小鼠进行T检验,强迫游泳时间明显延长(P0.001);Lenti-sh PTPRR+CMS组与control+CMS组小鼠进行T检验,强迫游泳时间明显减少(P0.001)。4.在悬尾实验中,各组间具有显著性差异(F=10.215),Lenti-GFP组和control组两组间T检验无显著性差异;Lenti-sh GFP组和control组两组间T检验无显著性差异(P0.05);Lenti-PTPRR组分别与Lenti-GFP组进行T检验,小鼠不动时间无明显差异(p0.05);Lenti-sh PTPRR组与Lenti-sh GFP进行T检验,不动时间明显减少(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS组与control+CMS组小鼠进行T检验,不动时间无明显改变(p0.05);Lenti-sh PTPRR+CMS组与control+CMS组小鼠进行T检验,强迫游泳时间明显减少(P0.001)。5.在糖水实验中,各组间存在显著性差异(F=16.19),Lenti-GFP组和control组两组间T检验无显著性差异;Lenti-sh GFP组和control组两组间T检验无显著性差异(P0.05);Lenti-PTPRR组分别与Lenti-GFP组进行T检验,小鼠糖水消耗率存在明显降低,存在统计学差异(p0.05);Lenti-sh PTPRR组与Lenti-sh GFP进行T检验,糖水消耗率未有明显改变,无统计差异(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS组与control+CMS组小鼠进行T检验,糖水消耗明显降低,存在统计差异(p0.001);Lenti-sh PTPRR+CMS组与control+CMS组小鼠进行T检验,糖水消耗明显降低,统计具有差异(P0.001)。结论:1.成功包装产生PTPRR过表达和PTPRRsh RNA高滴度慢病毒颗粒;2.成功建立PTPRR基因过表达和基因沉默小鼠模型;3.PTPRR过表达可以引起小鼠抑郁行为的增加,PTPRR基因过可能对于应激更为敏感;4.PTPRR基因沉默可能会改善抑郁小鼠的绝望行为。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R-332;R749.4
【图文】：

病毒颗粒,基因沉默,硕士学位论文,过表达

山西医科大学硕士学位论文2 结果.1 PTPRR 基因过表达和 shRNA 病毒的包装.1.1 实时荧光定量 PCR 检测包装病毒在 293T 细胞的表达经实时荧光定量 PCR 检测发现，本实验所包装的 PTPRR 过表达病毒颗粒（图中示：PTPRR 组）较其空白载体（图中所示：GFP）在 293T 细胞中 PTPRRmRNA达明显升高；包装的四种 PTPRR 基因沉默病毒颗粒（图中所示：shPTPRR1、hPTPRR2、shPTPRR3、shPTPRR4）较其空载体（图中所示：shGFP 组）在 293T 细中 PTPRRmRNA 表达明显降低。

小鼠,滴度,基因沉默,表达水平

20滴度：10-5滴度：10-6图2-2 293T细胞免疫荧光结果(x20)2.2 PTPRR 基因过表达及基因沉默小鼠的验证2.2.1 小鼠海马注射 28 后，海马区 PTPRRmRNA 的表达使用 RT-PCR 的方法检测各组小鼠海马区 PTPRRmRNA 表达水平，结果发现Lenti-GFP、Lenti-shGFP 与空白组比较，PTPRRmRNA 表达无显著差异（P>0.05）

小鼠,海马,对照组

统计具有差异（p＜0.01）；PTPRR 基因过表达组小鼠较其空载体对照组小鼠，海马区 PTPRRmRNA 明显下降，统计具有差异（p＜0.01）。图2-3 病毒注射28后，PTPRRmRNA在小鼠海马的表达2.2.2 小鼠海马注射 28 后，海马区 PTPRR 蛋白的表达使用 Western-blot 的方法检测各组小鼠海马区 PTPRR 蛋白表达水平，结果发现：PTPRR 基因沉默组小鼠较其空载体对照组小鼠，Lenti-GFP、Lenti-shGFP 与空白组比较，PTPRRmRNA 表达无显著差异（P>0.05）；海马区 PTPRR 蛋白水平明显下降，统计具有差异（p＜0.01）；PTPRR 基因过表达组小鼠较其空载体对照组小鼠，海马区 PTPRR 蛋白水平明显下降

【参考文献】