基于流感病毒H3亚型保守序列重组Ferritin免疫原性分析及保护活性的初步研究

发布时间：2020-08-23 12:28

【摘要】：流行性感冒是由流感病毒引起的传染病,其特点是流行突然、迅速蔓延、波及面广且具有一定的季节性,也被成为季节性流感。流感病毒分为A、B、C三型,甲型和乙型流行范围最广,其中甲型流感病毒(IAV)分类根据其包膜糖蛋白红细胞凝集素(H1~H18)与神经氨酸酶(N1~N11)的差异。WHO报告显示每年流感会感染世界5-10%人口,发病人口在300-500万人,导致二十万人至五十万人死亡。H3亚型流感病毒是造成季节性流感的主要亚型之一,存在着成为大流行毒株或为大流行毒株提供基因的可能性,是流感防治的重点。其中预防流感的最有效的措施是接种流感疫苗。流感病毒HA蛋白具有HA1球状头部区结构域与HA2颈部区结构域,其中HA1头部球状区可以与宿主表面受体唾液酸受体结合,HA2颈部区可以在低pH(5-6)条件作用下,发生构象变化,拉近与细胞膜距离,促使细胞膜与病毒之间膜融合。HA蛋白作为流感病毒功能蛋白成为研究的热点。HA蛋白HA1头部区的氨基酸序列高频突变性以及糖基化修饰的保护作用是疫苗设计的难点。其HA2颈部区结构相对保守,但是由于暴露时间短,免疫原性差,无法诱导较强免疫反应,也是疫苗设计的难点之一。构建具有HA三聚体结构的重组蛋白,模拟流感病毒感染时的天然构像一直是研究的热点。同时随着针对HA2广谱中和抗体的发现,利用HA2全长或HA2保守区表位作为免疫原诱导广谱中和抗体的方式得了关注。基于此本实验组通过保守序列分析得到了一段保守的HA2表位:DLWSYNAELLVALENQ。由于该表位分子量小,将其连接于诺如病毒P颗粒免疫小鼠,得到了具有中和活性的抗体,该免疫原可以诱导针对HA2颈部区抗体,阻止HA2结构变化,抑制膜融合。由于诺如病毒在人体中可能存在预存免疫,同时为了进一步验证该表位可靠性,本课选择新的载体连接HA2表位进行实验。研究表明Ferritin蛋白可以自组装形成直径为12nm的24聚体,其N段可以插入外源基因,在插入HA蛋白后可以使蛋白形成三聚体构象。但是Ferriitn对于多肽的递呈能力尚不清楚。基于上述分析,我们期望获得保守的HA,HA2,HA2(90-105)蛋白序列连接Ferritin载体,形成有三聚体构象的免疫原。同时验证HA2(90-105)表位的可靠性以及Ferritin载体对短肽的递呈能力。我们分析了1920-2017年的H3亚型的HA蛋白序列,得到了保守的HA全长,HA2全长序列。将三段序列用SSG linker分别连接Ferritin蛋白,便于形成三聚体构象以及暴露表位与Ferritin外。为研究糖基化对HA蛋白的影响,我们采用哺乳细胞与E.coil两种表达体系进行表达。其中HA全长(762aa),HA2全长(412aa),在两种表达体系中,均无蛋白表达,通过序列分析认为可能表达体系选用错误。HA2(90-105)在哺乳动物细胞表达体系中有少量表达,在E.coli表达体系中可以大量表达,经过蛋白纯化,粒径分析,电镜观察进行结构表征,得到具有12nm直径的球形结构免疫原进行免疫,期望可以获得针对流感病毒HA2保守序列的具有广谱中和活性抗体。我们使用弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂免疫,以不同剂量的重组蛋白,免疫BALB/c雌鼠,间隔两周,免疫四次。以PBS,Ferritin蛋白作为阴性对照,H3N2病毒作为阳性对照。检测免后血清与HA2表位特异性抗体水平,弗氏佐剂免疫组针对表位特异性抗体效价约为10~4,不同剂量产生抗体效价相似,说明重组蛋白具有一定免疫原性且与剂量无关。铝佐剂组效价随剂量升高而减少,且低于弗氏佐剂组,病毒对照组未产生特异性抗体。免后血清对H3N2 HA蛋白具有一定的结合能力,弗氏佐剂组高于铝佐剂组。弗氏佐剂组免后血清与H3N2病毒抗体效价约为10~5,铝佐剂效价低于弗氏佐剂组。四次免疫后,使用H3N2病毒进行加强免疫,弗氏佐剂组HA2表位特异性抗体水平明显升高,抗体效价升高约为10~3倍。铝佐剂组抗体水平虽有升高,但是低于弗氏佐剂组。结果说明,弗氏佐剂可以更好的增强重组蛋白免疫原性。由于HA2(90-105)表位处于HA2颈部结构域,所诱导抗体无法结合HA1头部区,所以免疫血清理论上不会出现血凝抑制现象,实验结果一致。抗体分型实验发现,免疫血清IgG1,IgG2a,IgG2b均有显著提升,说明重组蛋白主要诱导是体液免疫,但是IgM水平没有明显升高,体液免疫水平并不理想。体外微中和实验结果表明,弗氏佐剂组免疫后血清与相比,免疫前血清对H3亚型中和活力明显提高,弗氏佐剂100μg组ID 50为863.7,比免前血清ID50高6.16倍,具有较好的中和活性。氢氧化铝佐剂100μg组比免前血清ID50仅高1.21倍。结果显示,弗氏佐剂免疫小鼠可以获得具有中和能力的血清,氢氧化铝佐剂不能诱导小鼠产生中和抗体。结合Elisa实验结果,氢氧化铝佐剂无法有效地增强重组蛋白免疫原性,导致血清中和活力中和较弱。小鼠免疫重组蛋白后,采用H3N2病毒进行攻毒。每24h测量小鼠体重。PBS组体重下降38%,Ferritin组下降33%,弗氏佐剂组体重下降不足5%,铝佐剂组体重约10%-20%。说明免疫重组蛋白对小鼠具有一定保护能力。综上,以Ferritin为载体的HA2(90-015)表位重组免疫原对H3N2具有一定的中和能力。HA2(90-105)表位是潜在的广谱中和疫苗候选表位。Ferritin对于HA2(90-105)的递呈较弱,其递呈表位抗原的能力还有待进一步研究。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

流行情况,数据来源,流感病毒,流感

图 1.2 2016-1017 年中国流感病毒流行情况（数据来源：中国国家流感中心）图1.3 The putative evolutionary history of the eight genes of the new A(H1N1)virus.[12]2

结构图,流感,甲型,结构图

图 1.6 甲型流感结构图[25].4 流感病毒感染机制在流感病毒入侵宿主细胞时，被活化的 HA 蛋白通过结合宿主细胞膜表白以及糖脂唾液酸受体的末端[26]。结合之后，病毒颗粒通过胞吞进入细 pH 的胞吞小泡诱导 HA2 末端疏水的自由氨基酸残基插入小泡膜中导致象变化，使病毒膜与细胞膜进行融合，释放病毒 RNA 到宿主细胞[27,28]。在病毒核衣壳进入宿主细胞细胞核后，病毒开始进入第一个复制周期期RNA聚合酶开始首先转录翻译NP以及NS1蛋白，宿主细胞mRNA转断[19]。大量游离的 NP 导致，病毒内 mRNA 合成减少，同时 cRNA 以及 v成增加。vRNA与游离的NP 结合，作为下个复制周期的模板[29]。后期主 HA，NA，M1 蛋白。HA 和 NA 蛋白经宿主细胞修饰后，会被高尔基体细胞表面，成为包膜蛋白。NA蛋白会切割细胞膜上糖蛋白以及糖脂唾液

保守性,序列

第三部分实验结果与分析第三部分实验结果与分析3.1 流感表位的筛选我们分析了 10739 株 H3 亚型全长保守序列，以及 HA2 保守序列。获得了一株保守的HA序列以及HA2序列。HA氨基酸序列与A/Kansas/04/2009（H3N2）一致，HA2 序列氨基酸序列与 A/Kansas/04/2009（H3N2）的 HA2 一致。HA2（90-105）序列来源于本实验组前期分析。该序列具有 T 细胞与 B 细胞表位。保守序列通过 weblogo 网站得出。

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