淡色库蚊RNA-seq及CPGs与抗药性关系的研究

发布时间：2020-08-23 18:12

【摘要】：蚊虫传播许多疾病,包括疟疾、登革热、西尼罗河热、日本脑炎、丝虫病等,是媒介传染病中重点防控的媒介昆虫。化学防制因具有简单快捷、方便高效等优点,自20世纪50年代以来,一直是媒介传染病防治的主要策略,然而随着化学杀虫剂的大范围、连续、不规范使用,蚊虫面对自然和人为选择压的作用,抗药性逐渐产生,并不断发展,目前,蚊虫抗药性的发展速度已远远超过人们对它的抗药性控制步伐,加重了全世界媒介防治工作的负担,也使得全球公共卫生问题成为继全球变暖之后,需要各国加强合作,投入更多的人力和资金来面对的重要难题。蚊虫抗药性的分子机制主要体现在:代谢抗性、靶标抗性(kdr抗性)、表皮抗性和行为抗性。但蚊虫抗药性产生的本质是由基因突变造成的,包括基因拷贝数目的差异,基因表达量水平的改变以及基因结构的变异。目前,代谢抗性和靶标抗性已被广泛研究,而表皮抗性和行为抗性的研究则相对较少。蚊虫的表皮覆盖着其整个身体表面,在其发育过程中起着保护形体,防御外来不利因素的作用,毫无疑问,表皮极大地增强了蚊虫的生存和适应能力,以确保蚊虫发展为昆虫界最为成功的类群之一。表皮在杀虫剂抗性中发挥着减少渗透率和隔离杀虫剂的作用。本实验室选取淡色库蚊各生理发育阶段的虫体,分别是:I、II、III、IV龄幼虫、蛹和羽化3天后的未吸血的雌蚊,提取完整mRNA后,运用新一代高通量测序技术,以Illumina Hiseq为平台,在全基因组范围内鉴定与抗药性有关敏感品系与抗性品系中差异表达的基因,并从中筛选出与表皮相关的蛋白基因,筛选标准是log2 Fold change3.0且Padj0.05,称为显著差异表达基因,并采用实时荧光定量PCR进行实时表达量的验证。主要研究结果如下:1.使用Illumina Hiseq平台对敏感品系和抗性品系2组样品进行监测,每组样品3个重复,共计6个样品,每个样品的平均产出数据是6.66Gb,原始数据过滤后,将得到的Clean reads与致倦库蚊的基因组比对进行二次整合,得到新转录本13,517个,其中4,199个属于lncRNA,属有蛋白编码基因的新的可变剪接亚型的有8,653个,未知蛋白编码基因的转录本有665个。2.差异表达基因:敏感品系与抗性品系对比的3组重复样本中,表达上调基因分别有1035个,944个和657个基因,而表达下调基因分别有2680个,1215个和975个基因,3组样本组间比较后,共有167个表达上调基因,145个表达下调基因。3.Gene Ontoloty(GO)功能分析:GO功能分析分为分子功能、细胞组分和生物过程三大功能类,分子功能层面共有224个基因参与,细胞组分层面共有149个基因参与,生物过程则有272个基因参与。4.目的基因验证:对组间差异比较后的差异表达基因进行分析,筛选出3个目的基因,实时荧光定量PCR验证后,抗性品系中XM_001845883.1的表达高于敏感品系,提示该表皮蛋白基因参与蚊虫抗药性的形成。本研究报告了淡色库蚊氯氰菊酯抗性品系与敏感品系的转录组测序分析结果,同时挑选并验证了3个表皮蛋白目的基因与蚊虫抗药性的关系。该研究不仅为进一步解释蚊虫表皮抗性的形成原因提供适当的科学依据,而且为进一步开发以表皮蛋白为靶标的新型杀虫剂提供了新的思路。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R384.1
【图文】：

转录组,淡色库蚊,比对鉴定

整性检测：用 DEPC 水在通风条件下浸泡电泳槽 2 小时，后用酒精 1ulRNA 和 9ul lodding buffer 混匀，150v 电压，时间为 30min 胶电泳，进行条带比对鉴定 RNA 完整性。淡色库蚊转录组测序的研究流程取本实验室饲养的淡色库蚊氯氰菊酯抗性品系和敏感品系，提取使用 DNase I（RNase free）去除残余的 DNA，使用 NanoDrop 核酸蛋白测定仪测定 RNA 浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的 RN后构建 cDNA 第一、二链反应体系,合成 cDNA 第二链后，将双平，加接 EcoRⅠadaptor 接头，末端的磷酸化及 XhoⅠ酶切后，使回收 dscDNA。随后使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 和 ABI Stepme PCR System 进行质量检测，质量合格后方可使用 Illumina HiSNA-seq。具体操作流程如下图：

基因组,碱基,质量值,致倦库蚊

测序的原始数据 raw reads 是指质量较低、接头出现污染以及未知碱基 N>5%的 reads，数据分析前需去除这些 raw reads,以保证结果的准确性和可靠性。我们使用内部软件进行过滤，具体步骤如下：1) 去除包含接头的 reads(存在接头污染)；2) 去除未知碱基 N 含量大于 5%的 reads；3) 去除低质量的 reads (我们定义：质量值低于 10 的碱基与该 reads 总碱基数之比大于 20% 的 reads 为低质量的 reads)。过滤后得到的高质量 reads 我们称为 "Clean Reads" ，并以 FASTQ［31］格式保存。（2）参考基因组的比对我们使用 HISAT［32］软件（版本：v0.1.6-beta；参数：phred64；sensitive；no；discordant；no mixed；I 1；X 1000）将 clean reads 比对到参考基因组—致倦库蚊的基因组上。

相对丰度,外显子,剪接位点,亚型

济南大学硕士学位论文只有其中之一被连接；⑤可变的外显子 5’剪接位点；⑥可变的外显子 3’剪接位点；⑦内含子滞留（intron retain），外显子连接时连同内含子一起连接，真核生物体内此方式发生率最低，约占 5%。为检测不同样品之间的差异剪接基因( DSGs )，我们使用 rMATS［36］软件。rMATS 是一款用于 RNA-seq 后对数据进行 DSGs 检测的软件，可计算样品测序后出现的 inclusion 亚型和 skipping 亚型的相对丰度，如图 3 所示，同时计算相应的 P、FDR 值来衡量样品间剪接差异的显著性，这里我们使用 FDR <= 0.05 作为判断标准，将小于该阈值的 DSGs 定义为显著差异的 DSGs。

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