眼镜蛇毒单克隆抗体的制备及活性鉴定

发布时间：2020-08-23 22:29

【摘要】：研究目的应用杂交瘤技术,制备抗眼镜蛇毒的单克隆抗体,为抗蛇血清的制备提供新的生产方法,解决抗蛇毒血清短缺问题,为蛇伤救治提供帮助。研究方法一.免疫小鼠用定量的眼镜蛇毒(Naja naja atra Venom NAV)溶液作为抗原,与佐剂完全混合并乳化后,通过皮下多点注射免疫balbc小鼠。二.细胞融合提取免疫小鼠血浆,采用间接ELISA法测定并筛选出效价高的免疫小鼠血浆。分离出该免疫小鼠的脾脏,获得致敏B细胞。利用PEG的作用将其与同源的SP2/O骨髓瘤细胞进行融合,产生具有两者特性即能产生抗体又能不断生长的杂交瘤细胞。三.细胞筛选以HAT、HT培养基选择培养杂交瘤细胞,去除非杂交瘤细胞。以间接ELISA法测定不同杂交瘤细胞上清反应性,筛选出强阳性的杂交瘤细胞,然后利用有限稀释法制备单克隆细胞株。根据该杂交瘤细胞所处的96孔板的位置命名所获得的强阳性杂交瘤细胞。四.抗体制备将产生的单克隆细胞培养至10~6个/ml后,接种于提前给予液体石蜡的小鼠腹腔,产生含有高效价的单克隆抗体的腹水并命名为抗眼镜蛇毒腹水(anti-cobra venom ascites ACA)。五.活性鉴定1.以间接ELISA法检测ACA,确定其抗体效价。2.利用不同的亚型抗体与ACA反应性的差别,采用间接ELISA法检测ACA的抗体亚型。3.应用竞争ELISA法检测ACA的结合能力,确定其的亲和力。4.以间接ELISA和双向免疫扩散实验检测不同蛇毒和ACA的反应性,确定ACA的种属特异性及其与特异抗原的结合能力。5.用间接ELISA和双向免疫扩散实验检测ACA和NAV主要毒性成分的结合反应能力,初步观察ACA的减毒机制。6.用中和实验检测ACA对NAV急性毒性的影响,确定其对NAV的中和活性。7.用体内保护实验检测ACA对NAV急性毒性的影响,观察其对NAV中毒小鼠的治疗作用。8.用中和实验检测ACA对眼镜王蛇毒急性毒性的影响,观察其对眼镜王蛇毒的中和活性,了解ACA对眼镜蛇科蛇毒的交叉反应。研究结果一.建立一株产抗眼镜蛇毒抗体的杂交瘤细胞株BE12B5本研究经免疫小鼠、细胞融合、细胞筛选等实验流程,筛选出一株稳定性好、分泌能力强的杂交瘤细胞株BE12B5,并制备出了高效价的抗眼镜蛇毒腹水(ACA)。二.抗眼镜蛇毒抗体的部分生物学表征经检测,BE12B5细胞株上清的抗体效价可达1024,抗体亚型为lgG1,ACA效价大于400万,亲和力常数为2.0×10~(-7)L/mol。一般认为亲和力常数在10~(-8)~10~(-11)L/mol内的单克隆抗体为高亲和力,ACA具有较高的亲和力。三.ACA的种属特异性间接ELISA和双向免疫扩散实验发现ACA不仅对NAV有特异性的结合反应,对眼镜王蛇毒亦具有较强的特异性结合反应,它们的结合能力和对照组比较具有统计学差异(P0.0001)。ACA对银环蛇毒、蝮蛇毒、蝰蛇毒、五步蛇毒则无特异性结合反应,它们的结合能力和对照组比较无统计学差异(P0.05)。四.ACA体外与NAV混合对眼镜蛇毒毒性的影响在体外中和实验中,发现10ul(很低剂量)ACA与不同浓度的NAV混合后腹腔注射,能使NAV中毒小鼠死亡率降低,存活时间延长。NAV的LD_(50)由1.623mg/kg上升至1.903mg/kg。以中和效价ED_(50)作为所得抗眼镜蛇毒抗体的活性指标,计算ACA保护50%小鼠不死亡的每毫升抗蛇毒单抗所能中和的蛇毒质量ACA的中和效价ED_(50)值为3.806mg/ml,95%可信区间为3.592~4.028mg/ml。五.ACA对NAV中毒小鼠的治疗作用在体内保护性实验中,10ul ACA腹腔注射使NAV中毒小鼠死亡率降低,小鼠的存活时间延长,眼镜蛇毒的LD_(50)由1.623mg/kg上升至1.809mg/kg。ACA对NAV的治疗效价ED_(50)值为3.618mg/ml,95%可信区间为3.302~3.958 mg/ml。六.ACA对眼镜王蛇毒毒性影响在体外中和实验中,10ul ACA与不同浓度眼镜王蛇毒混合后腹腔注射,可使眼镜王蛇毒中毒小鼠的LD_(50)值由0.568mg/kg上升至0.695mg/kg,由此推算ACA对眼镜王蛇毒中和效价ED_(50)为1.390mg/ml,95%可信区间为1.234~2.016mg/ml。结论本研究成功制备了一株稳定性好的眼镜蛇毒单克隆抗体细胞株BE12B5,并制备出了高效价的ACA。ACA为特异性抗眼镜蛇毒单抗,具有较高的亲和力,且它和NAV及其所含主要毒性成分─心脏毒素均具有强的反应性。在体外可以中和眼镜蛇毒,降低其毒性;在体内具有减毒作用,对于NAV中毒小鼠具有治疗作用,ACA对眼镜王蛇毒具有一定的交叉中和作用,亦能降低其毒性。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

血浆,小鼠,有限稀释,细胞株

图 2.1 免疫小鼠的血浆抗体效价Fig 2.1 The titer of anti-venom antibody in immunized mice plasma3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选细胞融合后，先利用 HAT、HT 培养基筛选去除非杂交瘤细胞，后利用间接ELISA 筛选阳性细胞。根据 ELISA 数据，选择 5 株阳性高的杂交瘤细胞株（AE1BE12、DE9、EC8、EH11）进行第一次有限稀释。再根据第一次克隆化的阳性率分析，BE12、AE1 细胞株阳性较稳定。从中再选择 3 株（BE12B5、BE12B6、AE1B5杂交瘤细胞株进行第二次有限稀释。根据阳性率分析，BE12B5 细胞株阳性高且克隆化过程稳定，故选择第二次克隆化中效价最高的一株细胞株命名为 BE12B5。BE12B5 经间接 ELISA 检测，该细胞株上清的抗体效价为 1024。故经过两轮的有限稀释，筛选出 1 株稳定性好、效价高的杂交瘤细胞株 BE12B5。

细胞株,克隆化,细胞融合,硕士论文

福建医科大学硕士论文表 2.3 细胞融合及克隆化过程的阳性率Tab2.3 Positive rate of cell fusion and cloning process类别细胞融合细胞株第 1 次克隆化细胞株第 2 次克隆化细胞株AE1 BE12 DE9 EC8 EH11 BE12B5 BE12B6 AE1B5性率（%） 35 47.8 93.1 6.8 28.2 5.3 79.2 8.9 10.4

亚型,理化性质,软件,单因素

数据统一使用 SPSS17.0 软件进行分析，给药前后采用配对样本 T 检验；各采用单因素的方差分析；数据主要采用 Graphpad Prism5 软件做图，P<0.05 说有统计学意义。结果1 ACA 理化性质的测定1.1 单克隆抗体亚型利用亚型抗体进行间接 ELISA 测定细胞株 BE12B5 上清的抗体亚型。结果 4.1 显示，BE12B5 上清对 lgG1 反应为强阳性，则单克隆细胞株的抗体亚型G1，具有统计学差异（P<0.0001）。统计分析

【参考文献】