人MHC双转基因小鼠模型制备及埃博拉病毒核蛋白MHC限制性表位研究

发布时间：2020-08-25 17:11

【摘要】：小鼠免疫系统与人类免疫系统在结构以及功能上非常相似,因此研究人员利用小鼠模型深入的研究了人体免疫系统的相关功能。但是,由于种属特异性的存在,在疾病致病机制、病原感染等方面,小鼠产生的免疫反应过程与人体产生的免疫反应过程差异显著。其中一个原因是MHC限制性差异,人类MHC分子为HLA,小鼠MHC分子为H-2。由于无法消除小鼠与人类间不同的特异性而导致的影响,因此很多基础研究中,无法有效地反映人体免疫系统的特征,进而影响临床实验研究,无法复制临床前实验动物的结果。而构建能够模拟人体免疫反应的人源化小鼠,可更有效的帮助人们了解疾病的致病机制以及疫苗、药物的研究,并提高临床前实验研究结果的准确性。MHC分子具有高度的多态性,同时各人群优势单倍型也有特征性分布,因此也导致了人群中各种各样的个体存在,为了抵御环境变化和病原入侵,某一群体会有相同或相似的MHC分子。这样导致某一种族,某一群体中MHC优势基因不尽相同,有着明显的差异。中国人群中,MHC-I类分子中,HLA-A2、HLA-A11和HLA-A24是优势亚型,但是欧洲人群以HLA-A2、HLA-A3和HLA-A1为主。在MHC-II类单倍型中,HLA-DR15在中国人群中占25%以上,HLA-DR1单倍型在中国人群中占的比例在10%~15%。而欧洲人群以及中东地区人群中,HLA-DR1、HLA-DR3和HLA-DR4为优势存在的单倍型。目前构建的人MHC转基因小鼠模型的策略是将外源HLA基因整合入小鼠基因组后,同时敲出小鼠内源的H-2基因的重要组分。此种策略构建的MHC转基因小鼠模型具有人MHC限制性反应特征,能够有效的应用于人类病原表位的筛选鉴定以及疫苗研发和评价等研究中。埃博拉病毒是一类丝状病毒,在人类和非人类灵长类动物中都会导致高死亡率的烈性传染病。2014年非洲地区发生埃博拉病毒最大规模的一次疫情暴发。尽管国内外已经进行了大量摸索及研究,但仍没有有效的治疗方法或临床应用的抗埃博拉病毒的疫苗。近年来,随着科学家们对埃博拉病毒蛋白质组学的深入研究,发现埃博拉病毒核蛋白是病毒主要结构蛋白之一,其在病毒复制和包装过程有重要作用,而且具有感染免疫保护作用。基于埃博拉病毒核蛋白,结合生物信息技术分析、预测和鉴定病毒表位,设计多肽表位疫苗,这也是病毒疫苗研发的新的技术途径之一。本论文首先是构建一种新型具有中国人群优势HLA-I类和HLA-II类单倍型的HLA-A2/DR15双转基因小鼠模型,并以实验室前期构建的具有中国人群优势HLA-I类及HLA-II类单倍型的HLA-A11/DR1双转基因小鼠进行埃博拉病毒核蛋白HLA-A11限制性CTL表位的筛选和鉴定研究。1.人MHC(HLA-A2/DR15)双转基因小鼠模型制备及功能分析将鼠源H-2-Iaβ的启动子和非编码区替换HLA-DRB1*15:01基因的启动子和非编码区,优化后的HLA-DRB15转基因载体显微注射将其整合到受体小鼠的基因组后,移植胚胎到代孕母鼠体内,获得HLA-DRB15首建鼠。将首建鼠与HLA-A2~(+/+)/DR1~(+/+)/H-β2m~(-/-)/IAβ~(-/-)双转基因小鼠进行杂交,并通过10代以上的自交和回交,获得可稳定遗传的HLA-A2~(+/+)/DR15~(+/+)/H-2-β2m~(-/-)/IAβ~(-/-)双转基因小鼠。通过基因检测HLA-A2基因和HLA-DR15基因在转小鼠模型基因组中表达,以及鼠源H-2基因的表达沉默;通过流式细胞术检测HLA-A类基因和HLA-DR类基因在HLA-A2/DR15双转基因小鼠脾细胞表面的表达明显高于对照组C57BL/6小鼠中的表达;并且,在双转基因小鼠体内也检测到了相对正常比例和数量的CD8~+T细胞和CD4~+T细胞,表明外源HLA分子能够在转基因小鼠体内,经过胸腺的阴性和阳性的选择,进而发育成为成熟的T细胞后,行使其相应细胞免疫功能。利用构建的重组腺病毒Ad5-EBOV-NP分别免疫HLA-A2/DR15双转基因小鼠或对照组C57BL/6小鼠,三次免疫后发现,HLA-A2/DR15双转基因小鼠体内的IgG抗体水平与对照组C57BL/6小鼠体内的抗体水平基相近,证明双转基因小鼠具有相对正常的体液免疫反应应答。通过生物信息学分析合成9个HLA-DR15限制性Th表位肽,其中AL-15、KA-15、FV-15、KS-15、YN-15和HA-15刺激免疫后的HLA-A2/DR15双转基因小鼠的脾细胞可产生大量IFN-γ,显著强于免疫后的野生型小鼠产生的IFN-γ,证明该转基因小鼠具有HLA-DR15限制性细胞免疫应答功能。以上结果表明,本研究成功制备了一种具有中国人群优势MHC限制性特征的HLA-A2/DR15双转基因小鼠模型。该模型可用于病原抗原HLA-DR15限制性表位的筛选鉴定、疫苗药物的研发以及疾病致病机制等研究。2.埃博拉病毒核蛋白HLA-A11限制性CTL表位筛选与鉴定本研究以埃博拉病毒核蛋白基因为研究对象,合成EBOV-NP基因序列,将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,线性化的穿梭质粒转化到BJ5183感受态细胞后进而重组到腺病毒系统的骨架质粒中。利用Pac I限制性内切酶酶切后,转染到AD-293包装细胞内。基于腺病毒相关的细胞病变效应鉴定转染的细胞,然后将重组Ad5-EBOV-NP病毒在AD-293细胞中再扩增并纯化。为了检测重组病毒的表达,用纯化的Ad5-EBOV-NP制备物感染AD-293细胞并在荧光显微镜下观察,以及用Western Blot方法可检测到EBOV-NP蛋白表达。利用重组腺病毒Ad5-EBOV-NP分别免疫HLA-A11/DR1转基因小鼠和野生型C57BL/6。每次免疫后收集血清,利用ELISA方法检测转基因小鼠体内IgG抗体应答。结果显示,三次免疫后,Ad5-EBOV-NP分别免疫转基因小鼠体内的抗体水平与对照组C57BL/6小鼠体内的抗体水平无显著差异;而Ad5-EBOV-NP免疫的转基因小鼠的抗体滴度显着高于对照重组腺病毒Ad5免疫的转基因小鼠的滴度。同时,利用生物信息技术分析和预测了EBOV-NP蛋白的HLA-A11限制性表位肽,基于预测的HLA-A11结合程度和常规疏水性,合成10个结合力较高的表位肽。分别用Ad5-EBOV-NP或Ad5免疫HLA-A11/DR1双转基因小鼠,利用ELISPOT方法检测发现10个多肽中有6个多肽,即GR-9、VR-9、QR-9、EK-9、PK-9和RK-9可诱导Ad5-EBOV-NP免疫小鼠的脾细胞产生的大量IFN-γ,比Ad5免疫的转基因小鼠诱导脾细胞产生的IFN-γ高4倍以上。进一步验证得到的6个表位是HLA-A11限制性的T细胞表位,用Ad5-EBOV-NP分别免疫HLA-A11/DR1或C57BL/6小鼠发现,其中GR-9、VR-9、EK-9、PK-9和RK-9这5个多肽可刺激Ad5-EBOV-NP免疫的转基因小鼠脾细胞产生显著强于免疫后的野生型小鼠脾细胞产生的IFN-γ。因此,利用HLA-A11/DR1小鼠鉴定得到了EBOV-NP蛋白中的5个新型HLA-A11限制性CTL表位,而QR-9由于在转基因小鼠和野生型小鼠均能产生细胞免疫反应,因此该表位肽并非HLA-A11特异性的。本研究成功制备新型HLA-A2/DR15双转基因小鼠模型,并证明其具有正常体液免疫反应及HLA-DR15限制性细胞免疫反应功能,该模型为抗原表位的筛选鉴定及新型疫苗、药物的研究提供了一种新技术手段。同时,利用HLA-A11/DR1双转基因小鼠模型进行了EBOV-NP蛋白HLA-A11限制性CTL表位的筛选鉴定,获得5个EBOV-NP蛋白HLA-A11限制性表位,为埃博拉病毒表位筛选鉴定及新型疫苗研究提供了新的基础。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373
【图文】：

结构示意图,非编码区,军事科学院,正向重复序列

军事科学院博士学位论文1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 HLA-DRB15 基因的合成与克隆参照 GenBank 数据库中获取的 HLA-DRB1*15:01 基因核苷酸序列（GenBank:HM067861.1），利用生物信息学综合分析基因密码子组成，GC 含量、正向重复序列和反向重复序列等进行核苷酸序列优化后的 HLA-DRB15 基因，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因长度为 3136bp，如图 1.1 所示，其中包括的小鼠 H-2-IAβ的启动子序列、5`非编码区、优化后的 HLA-DRB1*15:01序列以及 3`非编码区，并分别在序列的上游和下游添加酶切位点 Hind III，克隆到pET-32a 载体上。

示意图,示意图,转基因小鼠,分子

军事科学院博士学位论文.实验结果制备 HLA-A2/DR15 双转基小鼠模型的策略是同时将外源 HLA-A2 分子与LA-DR15 分子整合到野生型小鼠基因组，同时沉默 H-2-β2m 分子和 H-2-Iaβ分子功能，这样得到的转基因小鼠同时具有 HLA-A2 限制性和 HLA-DR15 限制性。验室前期已经获得 HLA-A2/DR1（HLA-A2+/+/DR1+/+H-2-β2m-/-/IAβ-/-）双转基因鼠，由于 HLA-DR 分子具有相同的α链，该转基因小鼠可提供 HLA-A2 分子的同也可提供 HLA-DRA 基因。因此，本研究首先构建 HLA-DRB15 转基因小鼠，其与 HLA-A2/DR1 双转基因小鼠进行杂交，获得 HLA-A2/DR15 双转基因小鼠型。制备示意图如图 1.2 所示。

酶切鉴定,重组质粒,质粒

图 1.3 pET-32a-DRB15 酶切鉴定B15质粒； 2：pET-32a-DRB15酶切结3：Trans 15K DNA Marker 1.4 pET-32a-DRB15 重组质粒 PCR 鉴 pET-32a-DRB15； 2：5×10-2ng pET-32

【参考文献】