孕期和哺乳期大鼠脑颞叶皮层和海马膜蛋白组学研究

发布时间：2020-08-25 18:20

【摘要】：生物膜上所包含的蛋白质统称膜蛋白,膜蛋白是细胞与周围环境之间进行物质交换和维系细胞生理功能的关键成分,执行许多重要的生物功能,如信号的识别与转导、离子交换、物质运输、细胞和组织结构的维护等。大多数膜蛋白不同程度地嵌入脂质双分子层中,其膜内部分由一些非极性氨基酸组成,与膜紧密结合;膜外部分则由极性较高的亲水性氨基酸组成。虽然传统的非离子性表面活性剂SDS可以使多数膜蛋白变性溶解,但SDS在后续样品处理过程中不容易除去,抑制质谱的离子响应,反而不利于肽段的检出;而非离子表面活性剂Triton-X的临界胶束浓度(CMC)较低,单独使用对于膜蛋白的溶解并不理想。本文建立了基于TM-PEK试剂盒提取、nanoLC-MS/MS分析鉴定大鼠脑颞叶皮层膜蛋白的方法。对比分析了TM-PEK试剂盒中的两种提取缓冲液(提取缓冲液2A和提取缓冲液2B)对乳鼠和成年大鼠脑颞叶皮层膜蛋白的抽提效果。孕期及哺乳期的女性的机体状态一直是深受关注的话题。孕期和哺乳期女性与正常时期的女性相比,在行为和生理方面发生明显变化,有许多独特的现象和规律,涉及一系列蛋白质合成、降解和磷酸化等状态的动态改变。SD大鼠生长快,繁育性能好,经常用于基础医学、药物安全性评价、生命科学及生长发育的相关研究,是动物实验研究中最常用的品种之一。理论上讲,在怀孕期和哺乳期整个过程中,大鼠的海马和脑颞叶皮层与正常老鼠相比会产生很大的差异。本研究旨在采用串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)标记技术比较孕晚期及哺乳期末SD大鼠与正常大鼠海马/脑颞叶皮层表达蛋白的差异。第一部分乳鼠及成年大鼠脑颞叶皮层膜蛋白组学分析方法的建立目的:建立基于Novagen ProteoExtract提取、Nano LC-MS/MS鉴定Sprague-Dawley大鼠脑颞叶皮层膜蛋白的组学方法,并用本法研究大鼠乳鼠及成年鼠大脑皮层的差异膜蛋白。方法:分离大鼠大脑皮层后,通过Novagen Proteo Extract跨膜蛋白抽提试剂盒(简称TM-PEK)中的不同提取液(提取缓冲液2A与提取缓冲液2B)抽提蛋白,经Filter Aided Proteome Preparation(FASP)酶解、Nano LC分离、Orbitrap Fusion高分辨质谱采集数据,通过Proteome Discover软件解析所提取到的蛋白,并对这些蛋白的疏水性、跨膜情况及生物信息学进行分析。结果:1.两种膜蛋白提取液的Nano LC-MS/MS鉴定结果如下,根据Proteome Discoverer 2.1软件搜库,提取缓冲液2A共鉴定出489个蛋白,1108个PMSs(Peptide matched spectra)。提取缓冲液2B共鉴定出2590个蛋白,8322个PMSs。2.两种提取液提取蛋白的物理化学性质结果如下,大部分被鉴定蛋白的MW分布在20-40 kDa的范围之间,pI分布在5-7和8-9的范围之间。与提取缓冲液2A相比,提取缓冲液2B鉴定的蛋白广泛分布于各MW和pI组中;提取缓冲液2A和提取缓冲液2B所鉴定GRAVY值为正值的蛋白数量分别是30(6%)和272(11%)个。与提取缓冲液2A相比,提取液2B对不同疏水性蛋白有更高的鉴定效率。两种提取液所抽提蛋白的TMDs分布有明显区别,提取缓冲液2B抽提出含有更多跨膜区域的蛋白,尤其是TMDs14的蛋白只在提取缓冲液2B中存在。与提取缓冲液2A相比,提取缓冲液2B更适用于酶解和鉴定含有高度疏水性多重跨膜区域的蛋白。3.2A提取溶液提取并鉴定到的成年SD大鼠的膜蛋白数量(1233个)明显多于乳鼠的膜蛋白(277个)。KEGG信号转导通路分析显示,成年SD大鼠的蛋白富集到蛋白酶体(proteasome,P=1.2E~(-21))、突触囊泡循环(synaptic vesicle cycle,P=4.0E~(-13))、碳代谢(carbon metabolism,P=1.6E~(-13))通路和丙酮酸代谢(pyruvate metabolism P=7.0E~(-8))通路;而乳鼠的蛋白则富集到剪接体(spliceosome,P=3.4E~(-11))、核糖体(ribosome,P=1.7E~(-6))通路中。4.2B提取溶液鉴定到的成年SD大鼠的膜蛋白数量为1679个,乳鼠的膜蛋白为1708个。KEGG信号转导通路分析显示,成年鼠的蛋白富集到GABA氨基丁酸突触(GABAergic synapse,P=2.6E~(-7))、谷氨酸能突触(glutamatergic synapse,P=8.0E~(-7))及多巴胺能突触(dopaminergic synapse,P=1.8E~(-5))。乳鼠蛋白则富集于RNA转运(RNA transport,P=4.4E~(-14))、内质网蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum,P=7.0E~(-6))、真核细胞的核糖体生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes,P=6.0E~(-4))等与蛋白质合成相关的通路中。结论:本研究建立了基于TM-PEK试剂盒提取、nanoLC-MS/MS分析鉴定大鼠皮层膜蛋白的方法,并研究了大鼠乳鼠及成年鼠皮层的差异膜蛋白,成年鼠以突触为代表的细胞间的联系发生了显著变化,而乳鼠蛋白的合成较成年鼠旺盛。第二部分孕晚期和哺乳期末大鼠脑颞叶皮层和海马膜蛋白差异的分析目的:本实验采用Percoll密度梯度离心法制备膜蛋白建立Nano LC-MS/MS鉴定Sprague-Dawley大鼠孕晚期和哺乳期末脑颞叶皮层和海马的组学方法,并用本法研究SD大鼠孕晚期和哺乳期末脑颞叶皮层和海马的差异蛋白。方法:制备大鼠的膜蛋白,使用TMT(Tandem Mass Tags)对蛋白进行定量标记。经Orbitrap Fusion高分辨质谱采集数据,通过Proteome Discover软件解析所提取到的蛋白,并对差异蛋白进行生物信息学分析。结果:1.在孕海马组差异蛋白与乳海马组差异蛋白中,236个蛋白在两组差异蛋白中均存在,439个差异蛋白只存在于孕海马组,1007个差异蛋白只存在于乳海马组。在孕皮层组差异蛋白与乳皮层组差异蛋白中,318个蛋白在两组差异蛋白中均存在,930个差异蛋白只存在于孕皮层组,558个差异蛋白只存在于乳皮层组。2.海马差异蛋白的KEGG信号转导通路分析显示,孕海马组差异蛋白主要参与的通路有氧化磷酸化通路(oxidative phosphorylation,P=7.83E~(-21)),乳海马组差异蛋白主要参与的通路包括催产素信号通路(oxytocin signaling pathway,P=6.78E~(-4))、卵母细胞减数分裂(oocyte meiosis,P=0.003)和胚胎与器官发育信号通路(wnt signaling pathway,P=0.006)。3.脑皮层差异蛋白的KEGG信号转导通路分析显示,孕皮层组差异蛋白主要参与的通路包括雌激素信号通路(estrogen signaling pathway,P=1.03E~(-4))和催产素信号通路(oxytocin signaling pathway,P=0.005),乳皮层组差异蛋白主要参与的通路包括孕酮调节的卵母细胞成熟通路(progesterone-mediated oocyte maturation,P=0.005)和催乳素信号通路(prolactin signaling pathway,P=1.43E~(-4))。结论:孕晚期和哺乳末期的海马/脑颞叶皮层的差异蛋白存在很大的差别,孕晚期脑颞叶皮层中表达更多的与雌激素信号通路的相关蛋白;哺乳末期的海马组织中表达更多的与催产素、胚胎与器官发育信号通路的相关蛋白,哺乳末期脑颞叶皮层中则表达更多的与催乳素信号通路的相关蛋白。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R338
【图文】：

流程图,流程

膜蛋白提取流程

膜蛋白,缓冲液,抽提,分子量

图 4 比较基于两种不同提取缓冲液抽提的膜蛋白的分布（A）分子量（MW）; （B）等电点（pI）; （C）平均疏水性（GRAVY）; （D）预测的跨膜区域（TMD）Fig.4 Comparison of the distribution of membrane proteins identified based ontwodifferent extraction buffers (A): Molecular weight (MW); (B): Isoelectricpoint (pI); (C): Grand average of hydropathy value (GRAVY); (D): Predictedtransmembrane domains (TMDs)

生物学过程,提取液,膜蛋白,细胞定位

25图 5 比较基于两种不同缓冲提取液抽提的膜蛋白的 GO 分析（A）定位；（B）分子功能；（C）生物学过程Fig.5 The GO analysis of cortex membrane proteins in rat cerebral cortecompared between two different extractions (A): Cellular component；Molecular function；(C): Biological processing

【参考文献】