几丁糖胶液复合物对腹腔粘连模型大鼠的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-08-27 21:06

【摘要】：腹腔粘连是腹部手术后的常见临床难题,术后发病率极高,并且伴有多种并发症,严重影响患者的身体及心理健康。目前在临床外科手术中应用的抗粘连药物种类繁多,大部分药物仅可以在一定程度上减轻粘连的严重程度,却无法做到根本性地防止粘连的发生,应用效果较为有限。因此,术后抗粘连药物的优化和创新是改变腹腔粘连现状的必要途径。防治术后腹腔粘连的方法主要分为药物防治和屏障防治两大类,二者各具有优缺点。药物防治主要是从提高腹腔纤溶活性、降低组织炎症反应、加速细胞外基质及胶原蛋白纤维的降解角度出发发挥预防腹腔粘连的作用。其缺点是大部分抗粘连药物均为液体材料,成膜性较差,导致其在创面受损部位滞留时间短,并且单组份药物的使用只能从单一方面发挥作用,无法做到多效保护。而屏障防治的优点在于可以阻隔受损部位与腹腔其他器官直接接触,为受损腹膜提供良好的修复环境,延长间皮细胞自我修复时间。其缺点是固体屏障类材料在手术过程中使用不便,且机体会发生异物反应,导致术后腹腔感染。由于腹腔粘连的发生机制较为复杂涉及多种因素,仅使用药物治疗或屏障治疗都很难达到预期效果,若将药物联合使用将会在很大程度上改变腹腔粘连的发生程度。目前,多糖类药物在抗炎、抗纤维化疾病、抗氧化及抗凝血等方面的作用已逐渐被学者们关注。几丁糖作为外科预防粘连发生的常用多糖类药物已在临床中广泛使用。几丁糖无毒、无刺激性,不会引起机体发生免疫反应,是一种良好的生物材料,可被生物体高度吸收和降解。几丁糖的优势在于具有促进血液凝固、抗菌、加速上皮细胞增殖、提高组织纤溶活性等特点。但几丁糖的缺陷是其急性止血作用不理想,无法做到快速且有效地止血。海藻多糖作为一种常用的医用敷料具有很好的止血作用,并且具有免疫调节功能。最为重要的是,海藻多糖成膜性好,海藻中的活性物质可以与皮肤蛋白结合生成生物膜,是很好的隔离屏障材料。但其对受损组织的修复功能较弱,远不如几丁糖对机体的生理性修复功能。多聚合纤维素作为术后防粘连材料不仅具有止血作用,还具有提高纤溶活性、促进纤维蛋白溶解的作用。几丁糖、多聚合纤维素和海藻多糖各有优势,缺陷互补,三者的联合应用既起到了药物防治粘连的作用,又可以作为屏障材料在受损部位成膜,延长药物作用时间,为机体提供良好的修复环境。本实验药中几丁糖含量最多,且对术后腹腔粘连的保护起到主要作用,因此,将该材料命名为几丁糖胶液复合物(Chitosan gel liquid Complex,CGLC),其具有一定黏性,保证药物发挥作用的同时,起到了屏障防治的作用。研究目的:通过建立大鼠腹腔粘连模型,探讨CGLC对大鼠术后腹腔粘连的保护作用并对其预防机制进行研究。研究方法:将90只Wistar雄性大鼠随机分为9组,每组10只。分别为正常对照组、假手术组、模型组、几丁糖溶液组、多聚合纤维素组、羧甲基壳聚糖组、CGLC低剂量组、CGLC中剂量组、CGLC高剂量组。除正常对照组和假手术外,其余各组利用手术刀片反复轻微刮擦盲肠末端及对应腹壁处至出现渗血点,并暴露大鼠盲肠于空气中使其充分干燥,通过此方法建立大鼠术后腹腔粘连模型。其中假手术组仅开腹后缝合,不进行造模。其余各组关腹前将药物滴加在各组大鼠受损盲肠表面及腹壁创面处。术后第14天开腹观察各组粘连形成情况,根据Nair、Zuhlke两种粘连评价标准将粘连进行分级评价。取盲肠创面组织进行病理学检测,通过HE染色观察盲肠组织的损伤程度、成纤维细胞的增殖情况;通过Masson和天狼星红染色观察盲肠组织中胶原蛋白的沉积情况。利用ELISA、QPCR、免疫组化等方法观察CGLC对受损盲肠组织中致纤维化因子TGF-β1的表达调控作用。利用ELISA、QPCR方法检测大鼠血清中及受损盲肠组织中t PA、PAI-1表达量以及炎症相关因子IL-6、TNF-α的表达。利用Western Blot方法,检测各组大鼠受损盲肠组织中纤维组织特异性蛋白ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen的表达水平以及MAPK炎症信号通路相关蛋白(TAK1/p-TAK1、JNK/p-JNK、P38/p-P38)的表达情况。采用超氧化物歧化酶试剂盒和丙二醛试剂盒利用分光光度法检测CGLC对氧化应激相关因子SOD和MDA的作用。研究结果:1.CGLC对大鼠术后腹腔粘连的保护作用。根据Nair和Zuhlke粘连分级评价标准,在术后第14天观察大鼠腹腔内粘连形成情况。结果发现,CGLC可以显著降低大鼠腹腔粘连程度及粘连发生率。HE染色结果显示,CGLC各剂量组盲肠壁结构清晰可见,肠壁外粘连组织少而薄,浆膜层结构基本修复,炎症细胞及成纤维细胞数量显著减少,胶原沉积程度显著下降。Masson染色和天狼星红染色结果显示,CGLC各组盲肠结构清晰可见,浆膜层外胶原沉积程度显著降低,其中CGLC中、高剂量组中浆膜层几乎无胶原蛋白沉积。2.CGLC对大鼠术后腹腔粘连模型中纤溶系统活性的影响。与正常对照组相比,模型组中受损盲肠组织及血清中的TGF-β1表达量均显著升高(P0.01);与模型组相比,CGLC各剂量组均可以明显下调TGF-β1表达水平;与三组阳性药比较发现,CGLC各剂量组中TGF-β1表达量显著降低(P0.05);CGLC各剂量组之间未出现显著性差异,但呈现出良好的量效关系趋势。在免疫组化结果中可以更直观地发现,与模型组相比,CGLC各组的TGF-β1的表达水平显著降低(P0.01)。与模型组相比,CGLC各剂量组均可以显著提高大鼠血清及受损盲肠组中t PA表达量,同时降低PAI-1表达水平(P0.01);与几丁糖溶液组、多聚合纤维素溶液组和羧甲基壳聚糖组相比,CGLC各剂量组中t PA表达量升高,PAI-1含量显著降低(P0.05)。与模型组相比,CGLC各剂量组ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen的蛋白含量显著降低(P0.01);与几丁糖溶液组、多聚合纤维溶液组和羧甲基壳聚糖组相比CGLC中、高剂量组ICAM-1、Fibrinogen的蛋白含量显著降低(P0.05),CGLC三组α-SMA蛋白含量显著降低(P0.05)。3.CGLC对大鼠术后腹腔内炎症反应的影响及机制研究。与模型组相比,CGLC各剂量组中的炎症因子(IL-6、TNF-α)在大鼠血清中和盲肠组织中含量均显著降低(P0.01);与几丁糖溶液组、多聚合纤维素溶液组和羧甲基壳聚糖组相比,CGLC各剂量组中的炎症因子(IL-6、TNF-α)含量显著降低(P0.05)。Western Blot结果显示:与模型组相比,CGLC可以显著降低磷酸化TAK1、磷酸化JNK、磷酸化P38的表达,抑制MAPK信号通路的激活。4.CGLC对大鼠术后腹腔内组织损伤引起的氧化应激反应的影响。与模型组相比,CGLC各组中抗氧化酶SOD酶活性显著升高(P0.05),与多聚合纤维素溶液组和羧甲基壳聚糖组相比,CGLC各组SOD酶活性显著升高(P0.05)。同时,与模型组相比,CGLC各组中MDA含量显著降低(P0.05),CGLC各剂量组之间未出现显著性差异,但具有良好的量效关系趋势。结论:1.CGLC可以减轻大鼠术后粘连形成程度,降低粘连发生率。改善粘连部位的病理损伤,对于术后腹腔粘连的形成具有良好的预防效果。2.CGLC可以抑制纤维化重要介质TGF-β1的表达,并且可以通过提高纤溶酶原激活剂t PA表达水平,抑制纤溶酶原激活剂抑制剂PAI-1的表达,提高大鼠术后纤溶活性,减轻腹腔纤维化程度。CGLC可以降低成纤维细胞表面特异性蛋白(ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen)的表达水平,抑制成纤维细胞的增殖,从而达到预防腹腔粘连的作用。3.CGLC通过降低术后腹腔内炎症因子的表达水平,下调控MAPK炎症通路的表达,从而抑制腹腔内的炎症反应。4.CGLC可以提高抗氧化酶活性,清除机体过多的自由基及过氧化物,降低氧化应激反应,防止机体因氧化损伤导致的生理性病变。总结:本研究首先证实了CGLC对大鼠术后腹腔粘连的形成具有保护作用。减轻术后粘连形成程度的同时,降低了大鼠术后腹腔粘连发生率。CGLC可以有效地保护大鼠术后受损盲肠的过度损伤,并且通过降低成纤维细胞的增殖及胶原蛋白在盲肠浆膜层的聚集,发挥其预防腹腔粘连的作用效果。随后,我们对CGLC发挥防粘连作用的机制进行探讨,明确了CGLC可以显著抑制纤维化重要因子TGF-β1的表达,降低了腹腔内纤维化程度。另外,我们通过观察纤溶系统相关因子t PA和PAI-1的表达水平,证实了CGLC可以激活纤溶酶原激活剂对纤维蛋白的溶解作用,并且CGLC可以有效地降低成纤维细胞表面标志蛋白的表达水平,抑制成纤维细胞的增殖。另一方面,由于腹腔粘连的发生与炎症反应密切相关,我们通过检测炎症因子及炎症通路的表达情况发现,CGLC可以显著降低术后炎症反应,这与其具有良好的抗粘连作用密不可分。并且CGLC可以降低术后组织损伤引起的氧化应激反应,提高抗氧化物酶活性,加速对自由基的清除能力,保持机体氧化还原平衡。本实验通过对多种抗粘连机制的研究,为该药物在预防术后粘连方面的应用奠定了理论基础,为药物联合预防腹腔粘连提供了研究思路。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965;R-332
【图文】：

盲肠,浆膜层,黑色,胶原沉积

Fig. 2.6 Masson staining observation of caecum in rats（100×）大鼠盲肠组织天狼星红染色狼星红染色病理学图 2.7 可以看出（黑色虚线框代表盲肠浆膜胶原蛋白形成情况），Model 组大鼠盲肠浆膜层表面损伤严重浆膜层外被染成红色的胶原纤维组织增生严重；与 Model 组组和 Poly-cellulose 组盲肠结构较清晰，浆膜层外被染成红色积程度有所下降，浆膜层结构轻微受损；Carboxymethyl chito构排列有序，胶原沉积程度下降；CGLC 各组盲肠壁结构清晰红色的胶原沉积程度几乎与 Control 组相当。结果表明，CGL

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