人脂肪干细胞表面标志表达谱的研究

发布时间：2020-09-05 12:34

　　目的:脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是来源于脂肪组织、具有自我复制和多种分化潜能的成体干细胞,具有广阔的临床应用前景。ADSCs功能的发挥在很大程度上依赖于其表面表达的分子,与细胞外基质及其临近细胞相互作用,并发挥对机体的免疫调节作用。既往大多数研究是针对某一个或某几个细胞表面分子,其弊端是不利于发现具有重要功能的关键分子以及表型和功能不同的新细胞亚群。人ADSCs参与迁移、归巢及免疫调节作用等的相关分子表达谱尚未见报道,ADSCs发挥免疫调节作用的机制也尚不完全清楚。本研究拟对体外培养获得的ADSCs进行表型鉴定及多向分化能力检测,采用流式细胞术检测86种细胞表面标志,以发现新的参与免疫调节作用的关键分子并对其表达和影响因素进行研究,为ADSCs免疫调节作用研究及在组织工程与细胞免疫治疗方面的临床应用提供科学依据。研究方法:1、脂肪组织样本来源:28例供者均为女性,经伦理委员会同意及供者知情同意,采集腹部或乳腺皮下脂肪组织约10ml。2、ADSCs体外培养:用胶原酶消化后,脂肪组织置于10%FBS低糖DMEM培养基培养,细胞长满80%以上,胰酶消化并传代。3、ADSCs表型鉴定:第4代贴壁细胞,用抗CD34、CD31、CD45、CD10、CD13、CD29、CD49d、CD90荧光抗体及荧光标记同型对照染色,流式细胞仪检测。4、ADSCs成脂、成骨、成软骨分化:分别用成脂、成骨、成软骨的培养基培养,第7天用油红O、第14天分别用茜素红S和甲苯胺蓝染色,鉴定成脂、成骨和软骨分化。5、ADSCs表面标志表达谱的检测:用6种荧光标记的86种抗体对10例ASDCs通过流式细胞仪进行检测,FlowJo软件进行分析。6、统计学分析:采用SPSS 19.0和Graph prism 5软件进行数据分析。两组间比较采用独立样本t检验。采用多因素线性回归分析影响ADSCs的PD-L1和Gal-9表达的因素。P0.05为有统计学意义。结果:1、表型鉴定:培养的ADSCs细胞不表达CD34、CD31和CD45,高表达CD10、CD13、CD49d、CD29和CD90,符合ADSCs表型特点。2、ADSCs分化能力检测:成脂诱导后染色,胞浆内见大小不等红色脂肪颗粒;成骨诱导后染色,见橘红色矿化结节;成软骨诱导后染色,细胞核和细胞浆蓝色,胞浆内见深蓝色异染颗粒。提示贴壁细胞具有多种分化能力,符合国际标准。3、ADSCs表面标志表达谱的检测:流式细胞仪的检测结果显示,ADSCs表达多种与免疫调节相关的细胞表面标志。3.1 HLA相关抗原的表达:ADSCs不表达HLA-DR,表达低水平的HLA-G,66.35%的ADSCs表达HLA-A B C。3.2细胞因子受体的表达:ADSCs表达低水平CD123、CD127、CD25和CD122,不表达的CD124和CDw210。60%-80%的ADSCs表达CD119。3.3趋化因子受体的表达:ADSCs不表达CD192、CD194、CX3CR1、CD181、CD182,表达低水平CD195、CD183,表达高水平的CD184。3.4粘附分子的表达:ADSCs表达CD54、CD226和CD56,不表达CD206、CD209以及CD205。3.5免疫共抑制分子的表达:ADSCs表达低水平Gal-9,同时表达PD-L1和PD-1,不表达TIM-3和CD152。3.6免疫共刺激分子的表达:ADSCs不表达CD80、CD86、CD28和CD40L,但表达低水平的CD40。4、ADSCs的PD-L1表达影响因素:乳腺脂肪组织ADSCs的PD-L1表达(37.24±8.2%)显著高于腹部(28.8±8.59%)(P=0.018)。多因素线性回归分析显示,年龄和采集部位显著影响PD-L1表达,BMI不是影响ADSCs PD-L1表达的因素。线性回归方程为:PD-L1~+ADSCs(%)=34.437+8.58×部位(腹部=0,乳腺=1)+(-0.385×年龄)。年龄每增加1岁,PD-L1表达降低0.385%。5、ADSCs的Gal-9表达影响因素:乳腺脂肪组织ADSCs的Gal-9表达(4.41±2.65%)显著高于腹部(2.51±1.39%)(P=0.039)。多因素线性回归分析显示,采集部位是影响ADSCs的Gal-9表达的独立危险因素,年龄和BMI不是影响ADSCs Gal-9表达的独立危险因素。线性回归方程为:Gal-9~+ADSCs(%)=0.623+1.894×部位(腹部=0,乳腺=1)。结论:1、腹部和乳腺均是人ADSCs的可靠来源。2、人ADSCs表达多种细胞因子受体、趋化因子受体、粘附分子以及免疫调节性分子,不表达或低表达多种共刺激分子。3、人ADSCs表达重要的免疫共抑制分子PD-L1和Gal-9,供者年龄、采集部位显著影响ADSCs的PD-L1和Gal-9表达。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

贴壁细胞,纤维状,倒置显微镜,表面标志

中国医科大学硕士学位论文CD34、内皮细胞标志 CD31 以及白细胞标志 CD45，CD10、CD13、CD49d、CD29和 CD90 的阳性细胞百分比分别为 98.1%（）高表达 CD10、CD13、CD49d、CD29和 CD90（图 1B），提示 28 例第 4 代的贴壁细胞符合 ADSCs 表面标志特点[6]。CD90出现双峰，提示并非全部的人 ADSCs 均表达 CD90，与 Chung 等的研究报道一致[10]。

色油,分化能力,见红,诱导培养

ADSCs分化能力检测A．成脂分化：油红O染色显示，成脂诱导培养7天，细胞浆内见红色油滴

【参考文献】