人呼吸道腺病毒55型的基因组学与病原学特征研究

发布时间：2020-09-08 14:06

　　人腺病毒(Human Adenovirus, HAdV)是一类无包膜的双链DNA病毒,分为A-G7个血清学组,包括56个血清型。HAdV经呼吸道和消化道传播,可引起人多种器官感染,对小儿和免疫缺陷者危害尤为严重。HAdV感染人体可引发急性腺病毒型肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎、乳糜泻和急性间质性肾炎等多种疾病。其中HAdV-B组感染目前已成为急性呼吸系统疾病(Acute Respiratory Disease, ARD)的重要因素。超过5%的急性呼吸道传染病为HAdV感染所致,特别是在急性下呼吸道感染儿童患者中HAdV感染阳性率最高可达37.3%。近年来,B2亚组中出现的新型HAdV-B55在成人特别是学校和军队特殊人群中引起日益频繁的急性呼吸道传染病流行。我国2009年首次报道了HAdV-B55疫情,导致247名师生及市民发病,1名学生死亡。考虑到]HAdV并未列入我国传染病监控病原,现有报道的HAdV疫情大多未鉴定型别,因此HAdV-B55在我国引起的成人急性呼吸道传染病流行可能远高于实际报道病例,其潜在威胁不容忽视。由于抗原性上与HAdV-B11的联系和差异,HAdV-B55早期被命名为HAdV-B11a。经全基因组序列测定和生物信息学分析,HAdV-B55实际为HAdV-B11和14的Hexon基因重组突变体。HAdV-B55作为一个新近受到关注的呼吸道感染类腺病毒,基因组及生物学特征均未明确。传统的HAdV-B11主要导致泌尿系统的感染,HAdV-B14和55则主要引起呼吸系统感染。因此,明确HAdV-B55的基因组及生物学特征,阐明重组HAdV-B55与其亲本病毒的联系及差异,以及进一步探讨呼吸道HAdV重组与其致病性上的联系,将可加深对呼吸道HAdV病原学的认识,并为进一步研究其重组与致病机制奠定基础。本项研究从HAdV感染咽拭子样本中,利用敏感细胞系分离获得了HAdV-B55病毒株,完成了病原学鉴定,对其基因组特征及其进化重组进行了分析,并进一步针对病毒重组,对HAdV-B55与亲本病毒11和14型在生物学特征上的差异进行了系统比较,明确了HAdV-B55型重组后生物特征学上的改变,并初步探讨了HAdV重组对病毒生物学特性的影响及其与致病性之间的联系。一、新型HAdV-B55的分离与鉴定我们自2011年山西HAdV-B55疫情中,从临床咽拭子样本中分离获得了HAdV-B55毒株Y16/SX/2011(简称Y16)。该毒株可感染呼吸道细胞系A549及HEp2,并引起明显的细胞病变,A549细胞在感染24小时后即可观察到细胞肿胀及圆缩等病变现象,随着感染时间的延长,在感染48小时后细胞逐步出现了类似拉网样空泡,而在感染5天后可导致细胞完全圆缩、脱落、融解。分离株可在A549细胞上有效增殖,病毒滴度最高可达2.45×108PFU/ml,并形成大小均一的噬斑形态。在电镜下观察HAdV-B55型病毒颗粒,HAdV-B55型具有与其他HAdV相似的电镜形态,呈现典型的二十面体形态。在感染细胞后,细胞颗粒主要集中于细胞核内,呈晶格状排列。小鼠体内实验显示Y16分离株无法感染小鼠和增殖,仅可引起非特异的病理性损伤。上述分离株病原学特征的初步鉴定,为进一步开展HAdV-B55型基因组分析、致病机制及疫苗的研究奠定了坚实的基础。二、HAdV-B55分离株基因组特征与进化重组分析为了进一步分析Y16分离株的基因组及进化特征,我们对其全长基因进行了序列测定和基因组标注,并进一步以Genbank公布的HAdVB组序列为依据,进行了进化分析。基于全基因组序列的进化关系显示Y16分离株属于]QS-AdVB2亚组。序列同源性分析表明Y16株与我国2006年山西的QS-DLL分离株相似度高,仅有8个核苷酸上的差异；与HAdV-B11的同源性为97.6%,而与HAdV-B14的同源性为98.9%。进一步对Y16主要表面衣壳蛋白Hexon、Fiber、Penton及E1A蛋白进行了生物信息学分析。结果显示分离株的Hexon与HAdV-B11型同源性较14型高为97.4%,与HAdV-B14型的同源性仅为92.5%；但其他几个蛋白如Fiber、Penton及E1A蛋白与HAdV-B14型的同源性均高于99%,显著高于分离株与HAdV-B11型的同源性。对分离株的进化关系分析同样证实了上述结果,基于编码蛋白Hexon、 Fiber、Penton及E1A基因的进化树分析发现,Y16的Hexon基因进化关系与HAdV-B11相近,而Fiber、Penton及E1A基因及进化关系均与HAdV-B14型属同一进行分支。进一步对Y16毒株进行重组分析,发现本次分离到的Y16株为HAdV-B11型的Hexon蛋白和14型重组后的新型]HAdV,其重组区为18695-19587位核苷酸区,其重组特征与之前文献报道一致。这些结果明确了我国HAdV-B55型的基因组及其变异情况,为HAdV流行分析与溯源,疫苗研制及制订疾病防控策略等提供理论依据。三、HAdV-B55与重组亲本病毒HAdV11/14的病原学比较研究为了明确HAdV重组对HAdV-B55生物学特征和致病性的影响,我们系统比较了重组Y16分离株与其亲本病毒HAdV-B11和14型细胞组织嗜性和体外生物学特征、不同温度环境中在细胞内的病毒增殖能力、蚀斑形态、生长曲线、热稳定性、诱导宿主细胞凋亡、细胞吸附能力和干扰素的动态变化等方面的差异。研究结果显示,HAdV-B55具有与HAdV-B11和14类似的一些生物学特征。三个型别的腺病毒均具有广谱细胞嗜性,在不同组织来源的细胞系内均可以实现有效的增殖；在A549细胞上均可形成典型的蚀斑形态。此外,三个型别]HAdV也可抑制细胞内干扰素的产生。电镜下未发现形态存在显著差异。进一步分析发现HAdV-B55与HAdV-B11和14体外致病性存在一些显著差异。HAdV-B55在A549、RD、HEp2、HepG2、HEK293和HeLa等六类细胞系内致病变能力、细胞毒性以及致细胞凋亡能力均明显弱于亲本病毒11及14型；上述特征将有利于病毒在细胞中的持续增殖。在模拟上呼吸道环境中,HAdV-B55增殖与HAdV-B14接近,但均快于HAdV-B11;在下呼吸道模拟环境中,HAdV-B55的增殖显著快于HAdV-B11和14,且在A549细胞上的蚀斑形态显著大于亲本病毒HAdV-B11和14型。在热稳定性比较分析中,我们发现]HAdV-B55型在37℃时的热稳定性明显弱于亲本病毒11和14型的稳定性。上述结果提示基因重组与氨基酸突变在HAdV-B55型致病机制中的重要作用,HAdV衣壳蛋白Hexon的重组,可能与HAdV的复制能力及热稳定性存在着联系。本部分的研究结果为下一步揭示基因重组与HAdV毒力变异的关联这一科学问题,为深入探索和阐明不同HAdV致病机制与流行特征奠定了基础。四、HAdV55快速检测方法的建立及评价为满足HAdV-B55快速检测筛查的需要,我们分别建立了环介导等温快速检测方法、实时PCR检测方法和区分HAdV-B11/14/55的多重PCR检测方法等。这些方法具有较好的敏感性和特异性。其中]HAdV-B55特异LAMP检测方法,灵敏度与实时定量PCR相当,均可以检测到0.008PFU/反应；同时,该方法还可无须提取核酸过程直接对样本进行检测,极大方便了对HAdV感染的甄别。我们将上述建立的三种快速检测方法应用到临床样本的检测中。实验证明三种方法均具有良好的特异性和灵敏度,可适应在不同环境中HAdV-B55检测及鉴定,可为临床及基层医疗机构/野外提供快速准确的诊断信息。本研究成功对人腺病毒55型Y16/SX/2011株进行了分离与鉴定,并完成全基因组序列测定与分析,明确了其与我国QS-DLL腺病毒55型分离株的8个核苷酸差异及其进化特征,重组分析显示分离株为HAdV-B11和14型的重组产物。进一步的病原学比较研究显示,HAdV-B55分离株在细胞嗜性,呼吸道细胞系上的增殖能力均强于亲本病毒11和14型,而细胞毒性及致细胞凋亡能力则弱于亲本株。本研究对HAdV-B55基因组特征与生物学特征的阐明,以及与其重组亲本的病原学比较,为深入研究腺病毒进化重组机制及其对病毒致病性的影响奠定了基础,并为腺病毒的防控及疫苗的研究提供了科学依据。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R373.1
【部分图文】：

细胞病变,病变特征

图1-1Y16分离株A549细胞的细胞病变特征（@37°C)A：未感染病毒A549细胞，B?F:分别为感染病毒1?5天后A549细胞病变特征Figure 1-1 CPE results ofY16/SX/2011 strain on A549 cells in 37°CA: Negative control, B-F; 1-5 days post infection2.1.2. Y16分离株30°C时对HEp2细胞致病变特征

病变特征,病毒

图1-2 Y16株在HEp2细胞病变特征（@3(rC)A：未感染病毒HEp2细胞，B?F:分别为感染病毒1?7天后A549细胞病变特征FIG 1-2 CPE results ofY16/SX/2011 strain on HEp2 cells in 30^0A: Negative control, B-H: 1-7 days post infection2.2分离株病毒烛斑鉴定为了分析分离株的感染能力及增殖特性，我们利用病毒烛斑试验来对其进行评价。t虫斑实验中，将分离病毒感染A549细胞第3天后即可观察到细胞内出现空泡现象，并随着感染时间的延长烛斑逐渐增大。在观察至第5天时以甲醛固定、结晶紫染色后进一步观察其烛斑形态，以未感染病毒细胞作为阴性对照。结果如图1-3显示，病毒在A549细胞上能形成肉眼可见的典型烛斑形态，且烛斑形成数目与病毒稀释度呈正相关。随机计数25个空斑后测量其空斑大小为0.32±0.066mm。

形态图,形态,空斑,病变特征

‘ a‘： *??. 、)?‘ -V *■.. -. 广?>V ■ ■：6dpi 7dpi. ■：1-2 Y16株在HEp2细胞病变特征（@3(rC)HEp2细胞，B?F:分别为感染病毒1?7天后A549细1-2 CPE results ofY16/SX/2011 strain on HEp2 cells in 30^0A: Negative control, B-H: 1-7 days post infection斑鉴定离株的感染能力及增殖特性，我们利用病毒烛斑试验中，将分离病毒感染A549细胞第3天后即可观察到感染时间的延长烛斑逐渐增大。在观察至第5天时一步观察其烛斑形态，以未感染病毒细胞作为阴性对在A549细胞上能形成肉眼可见的典型烛斑形态，度呈正相关。随机计数25个空斑后测量其空斑

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