H5N1亚型禽流感病毒核蛋白的表达及初步应用

发布时间：2020-09-10 15:00

　　甲型流感病毒常引起人和动物感染,H5N1亚型禽流感病毒为高致病性禽流感病毒。1997年,香港出现首个人感染H5N1亚型禽流感病毒并引起死亡的病例,高致病性H5N1亚型禽流感对人类健康和财产造成了巨大损失,在流感疫情发生初期,建立一种准确、快速、便捷、高效的检测方法,对于及时防控疫情的发展具有重要意义。流感病毒核蛋白(nuclear protein,NP)保守性较高,为流感分型和鉴定的基础。据报道NP蛋白可在原核和真核系统中进行表达,但各有优缺点。胶体金侧向免疫层析试纸条(lateral flow immunochromatographic strip,LFICS)是目前应用最广泛的一种即时检验(point-of-care testing,POCT)检测方式,具有成本低、检测时间短、适用于野外诊断等优点,可用于流感病毒的早期诊断及检测体内流感抗体产生情况。本研究分别利用大肠杆菌原核表达系统、昆虫杆状病毒真核表达系统分别表达H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade 2.3.2.1)NP蛋白,分别构建含有NP基因的重组载体,转化或转染E.coli或Sf9细胞,进行大规模培养和表达,应用间接免疫荧光、ELISA、SDS-PAGE、WB等方法对表达的NP蛋白进行鉴定。利用两个系统均能成功表达目的蛋白,但真核昆虫杆状病毒表达系统表达的NP蛋白和抗体具有较高的结合活性,利用此NP蛋白作为标记抗原,用竞争法和双抗原夹心法建立胶体金侧向免疫层析试纸条,根据特异性和灵敏性分析,昆虫杆状病毒表达系统表达的NP蛋白更适合用双抗原夹心法进行胶体金侧向免疫层析试纸条的制备。利用此胶体金侧向免疫层析试纸条检测不同亚型流感病原血清,监测不同亚型的流感病毒感染后或疫苗免疫后体内抗体产生。我们的研究结果表明,E.coli原核表达系统和昆虫杆状病毒真核表达系统均能够表达NP蛋白,成功利用真核表达系统表达的NP蛋白以双抗原夹心法建立胶体金侧向免疫层析试纸条,实现对流感病毒感染的监测及疫苗免疫效果评价,为防控流感病毒感染提供帮助。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65;R373.13
【部分图文】：

示意图,示意图,病毒抗原

图 1 LFICS 示意图品。当待测样品加入到样品垫上后，在吸水垫的毛细作用下待测样品流结合垫上纳米颗粒标记的抗体复合物复溶，形成样品-抗体-纳米颗粒复流经 NC 膜时，又分别和 NC 膜上的 T 检测线与 C 质控线发生反应，根的不同，对 T 线与 C 线的显色情况进行判读。制备试纸条，首先需要获得病毒抗原，现有病毒抗原的获取多采用原核流感 NP 蛋白的原核表达，通过 IPTG 诱导表达目的蛋白，优点是操作、表达产量高。但原核表达系统翻译后几乎没有糖基化修饰，表达的蛋，通过变性和复性，可将不溶性蛋白恢复为可溶性蛋白，但需要摸索出性条件。此外原核表达的蛋白由于缺少相应的糖基化修饰等，蛋白的天，可能存在抗原抗体结合活性低的现象。杆状病毒表达系统也是常用的真核表达系统之一。杆状病毒的宿主主要的宿主范围窄，不会感染其他种属的细胞，满足实验室对操作安全的要

PCR扩增,基因,蛋白,实验结果

1H5N1NP的PCR扩增1Mark2000；2H5N1NP基因PCR产物

图 2.1.2 H5N1 NP 的菌液 PCMark 2000；2-3 H5N1 NP 菌液 P 2.1.2-1 重组 H5N1 NP 双酶切验00；2 双酶切空载；3-6 双酶切和 Western blot 验证图 2.1.3 B 的 Western Blot 验

【参考文献】