人3、7型腺病毒灭活疫苗的前期研究

发布时间：2020-09-10 19:12

　　【目的】筛选疫苗生产用人3、7型腺病毒培养的细胞基质,分离、培养人3、7型腺病毒疫苗候选株,并进行空斑纯化。【方法】1、细胞基质的初步筛选:将已有的人3、7型腺病毒株分别感染5种细胞系:HEK293、AD293、Vero、MRC-5、WI-38,观察细胞病变情况和感染滴度,筛选出易感细胞系。并运用初步筛选出的易感细胞系AD293和MRC-5细胞分别培养、氯化铯密度梯度离心纯化携带GFP(Green Fluorescent Protein)基因的重组3型腺病毒感染A549细胞,观察细胞病变情况。从而筛选出一种培养3、7型腺病毒的疫苗生产用细胞基质。2、人3、7型腺病毒毒株分离及免疫:通过MRC-5细胞分离培养153份咽拭子样品(广州;北京)。PCR扩增腺病毒的六邻体蛋白基因、纤突蛋白基因、五邻体基座蛋白基因并测序进行型别鉴定。腺病毒分离株在MRC-5细胞中连续5次传代后,进行病毒感染滴度测定,筛选出感染滴度≥4.0 lg CCID_(50)/mL的腺病毒株。初步筛选病毒株在MRC-5细胞培养后经3次反复冻融,离心取上清,病毒上清按1:4000的比例加入β-丙内酯灭活,4℃放置24小时,再37℃放置2小时,最后腹腔注射小鼠,免疫剂量500ul/只。对照组腹腔注射PBS。免疫21天和44天后,获取血清,灭活后进行细胞中和实验。3、空斑纯化:分别采用Vero、A549、MRC-5细胞对腺病毒分离株(其抗体效价1:8)进行空斑纯化。纯化后腺病毒株采用三个主要蛋白基因的PCR扩增及测序及血清鉴别试验进行型别验证。再使用3种细胞系(A549、HEK293、MRC-5细胞)进行病毒感染滴度的测定。4、腺病毒培养条件初步建立:人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株分别使用病毒接种量为0.006MOI、0.012MOI、0.018MOI,培养基含血清浓度为2%、5%、10%,分别在35℃、37℃,含5%CO2培养箱培养,观察感染后12、24、36、48、60、72、84、96、108小时在MRC-5细胞病变的情况和感染滴度。【结果】1、5种细胞系中,人3型腺病毒在HEK293细胞最敏感,其次为MRC-5和AD293细胞,不敏感细胞为Vero和WI-38细胞;人7型腺病毒在HEK293和MRC-5细胞最敏感,其次为AD293细胞,不敏感细胞为Vero和WI-38细胞。重组3型腺病毒Ad3EGFP在相同培养条件下,MRC-5细胞培养获得总的病毒粒子为3.0×10~(11)而AD293细胞获得总的病毒粒子为2.04×10~(12)。但由MRC-5细胞获得的Ad3EGFP病毒感染A549细胞48小时后,接种1×10~7个病毒粒子可见细胞发出绿色荧光,而AD293细胞获得的病毒未见荧光。2、从153份咽拭子中分离得到31株腺病毒,其中21株为人3型腺病毒,10株为人7型腺病毒。筛选出11株病毒滴度"g4.0 lg CCID_(50)/mL的病毒株,其中6株为人3型腺病毒,5株为人7型腺病毒。11株腺病毒经β-丙内酯灭活后分别进行免疫原性检测,11株病毒株的初次免疫中和效价均1:8,免疫阳转率达到100%。初次免疫后,3型腺病毒株BJ-35、BJ-50、BJ-57、BJ-70302、BJ-70248共5株诱导的中和抗体效价无显著性差异。BJ-70327株诱导中和抗体效价均低于其他4株(BJ-35、BJ-50、BJ-57、BJ-70302)。7型腺病毒株诱导的中和抗体效价无显著性差异。二次免疫后不同3、7型腺病毒株诱导的中和抗体效价均无显著性差异,但二次免疫诱导的中和抗体效价均高于初次免疫。3、尝试采用Vero、A549、MRC-5细胞对11株腺病毒株进行空斑纯化,只有Vero细胞成功将腺病毒空斑纯化。纯化后病毒株进行3个主要蛋白基因的PCR扩增及测序、血清鉴别实验均证明腺病毒型别正确。分别使用A549、HEK293、MRC-5细胞系测定腺病毒感染滴度,11株腺病毒在MRC-5细胞和HEK293细胞的感染滴度一致,其中6株人3型腺病毒和3株人7型腺病毒的感染滴度均为5.0 lg CCID_(50)/ml,另2株人7型腺病毒感染滴度为lg 4.0 lg CCID_(50)/ml。在A549细胞测定感染滴度均比另2个细胞系高1个lg值。4、人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株在含10%血清的MEM培养基培养时,接种病毒量分别为0.006、0.012、0.018 MOI,导致病变均较快,培养48-60个小时可收获病毒,但最终收获的病毒感染滴度均未见明显差异。在含2%和5%血清的培养基培养时,接种病毒量分别为0.006、0.012、0.018 MOI,病毒感染滴度均未见明显差异,但含5%血清培养病变比2%血清培养的病变快,可提前24个小时收毒。无论是35℃还是37℃含5%CO2培养箱培养均未影响病毒感染滴度,但37℃培养病变较快,可提前24-36个小时收获病毒。人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株分别以0.012MOI病毒量接种于MRC-5细胞,使用含5%血清的培养基,在37℃,5%CO2培养箱培养12小时后病毒开始增殖,12-48小时病毒快速增殖,72小时细胞全部病变,48-108小时病毒滴度维持不变为5.2 lg CCID_(50)/mL。【结论】1、从5种细胞系(HEK293、AD293、Vero、MRC-5、WI-38细胞)中筛选确定MRC-5细胞为适合人3、7型腺病毒培养的细胞基质。2、从2015-2017年临床流行腺病毒感染样品中分离、空斑纯化获得6株人3型腺病毒疫苗候选株,5株人7型腺病毒疫苗候选株。3、确定疫苗候选株人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株接种培养的合适条件为:采用0.012MOI病毒接种MRC-5细胞,在含5%血清培养基,5%CO2,37℃培养箱中培养48-72hr。4、本研究为人3、7型腺病毒灭活疫苗的研发奠定了基础。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

细胞,腺病毒,放大倍数,分离培养

结果图 1-A、B：腺病毒不同细胞系（AD293、MRC-5 细胞）培养及纯化后感染 A54细胞（放大倍数 10×10）图 1-A：AD293 细胞生产纯化 rAd3EGFP 病毒；图 1-B：MRC-5 细胞生产纯化rAd3EGFP 病毒。2 腺病毒疫苗候选株筛选结果2.1 腺病毒分离培养结果腺病毒感染 MRC-5 细胞 48 小时后 CPE 情况见图 2，MRC-5 细胞病变为中间出现胀大、变圆及内容物增多。咽拭子标本共 153 份，用 MRC-5 细胞进行分离培养，共分离出 31 株病毒，结果见表 6，广州和北京地区的标本进行腺病毒分离培养结果进行卡方检验显示培养阳性率无显著性差异（ X2=1.784，P=0.182）。

六邻体蛋白,腺病毒,腺病毒3型,纤突蛋白基因

广州医科大学硕士学位论文检测,在凝胶成像系统下可见腺病毒六邻体蛋白基因 Ad3-Hexon 为 13Hexon 为 936bp，见图 3 所示；纤突蛋白基因 Ad3-Fiber 为 674bp、Ad3bp，见图 4 所示；五邻体基座蛋白基因 Ad3-Penton base 为 594bp，Ad7为 594bp 的条带，与预期的大小相符，见图 5 所示。PCR 产物送测序比对，分离 31 株病毒株中 21 株为 3 型腺病毒其中广州 10 株，北京 11 7 型腺病毒均来自北京，分离株基因型别与临床分型结果一致。

腺病毒,纤突蛋白,六邻体蛋白,腺病毒3型

分离 31 株病毒株中 21 株为 3 型腺病毒其中广州 10 株，北京 11 7 型腺病毒均来自北京，分离株基因型别与临床分型结果一致。图 3 PCR 扩增腺病毒分离株 3、7 型六邻体蛋白（Hexon）基因L5000 DNA Marker；1-6：腺病毒 3 型分离株六邻体蛋白 PCR 产物；7-1 7 型分离株六邻体蛋白 PCR 产物。

【参考文献】