MiR-142-5p高表达及抑制小鼠骨折模型建立及表型分析

发布时间：2020-09-11 18:16

　　第一部分MiR-142-5p高表达或抑制转基因小鼠模型的建立目的：建立miR-142-5p在骨组织内特异性高表达及抑制的转基因小鼠模型,以进一步分析miR-142-5p在小鼠体内对骨折愈合的影响。方法： (1)、首先合成pre-miR-142和miR-142-5p sponge序列,序列两端包含SalⅠ和EcoR Ⅰ酶切位点,插入到本实验室保存的含骨钙素启动子的表达质粒(pOG2-Cre-hGH)中,替换原质粒的Cre序列。构建好的质粒分别命名为Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S,经测序及酶切后电泳验证；(2)在MC3T3-E1前成骨细胞株中分别转染Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S质粒,使用含抗坏血酸及β-甘油磷酸钠的培养液诱导成骨分化72h,使用PCR法检测细胞内miR-142-5p表达水平变化；(3)将Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S表达质粒通过显微注射的方法注射到C57BL/6小鼠的受精卵原核内,待小鼠出生后3周使用PCR法鉴定表达质粒已整合到小鼠基因组中；(4)使用PCR法检测miR-142-5p和miR-142-5p sponge转基因小鼠不同组织内的miR-142-5p表达,验证两种小鼠是否存在骨组织特异性的miR-142-5p表达增加或降低。结果： 1、成功构建了含骨钙素启动子的pre-miR-142-5p和miR-142-5p sponge表达质粒,其能在MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化过程中表达,并导致细胞内miR-142-5p增加或降低； 2、成功构建了骨组织特异性表达的pre-miR-142-5p和miR-142-5p sponge转基因小鼠,可导致骨组织特异性miR-142-5p表达增加或降低。结论：成功构建了骨组织特异性miR-142-5p高表达或抑制的转基因小鼠模型,为下一步体内研究miR-142-5p在骨折愈合过程中的作用奠定了基础。第二部分MiR-142-5p高表达或抑制转基因小鼠模型的骨折表型分析目的：研究体内骨组织特异性miR-142-5p高表达或抑制对骨折愈合的影响,探讨miR-142-5p在骨折愈合中的作用机制。方法： (1)、使用单侧开放性股骨干横形骨切开术并锁钉内固定法,在野生型、rniR-142-5p骨组织特异性高表达型以及miR-142-5p骨组织特异性抑制型转基因小鼠中构建骨折模型；(2)、使用X线摄片、组织切片HE染色检测转基因小鼠骨折后7d、14d、21d的骨折愈合情况,观察miR-142-5p高表达或抑制对骨折愈合的影响；(3)、使用qRT-PCR法检测转基因小鼠骨折后0d、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨钙素表达水平,观察其表达模式；(4)、使用qRT-P(CR及Western Blot法检测转基因小鼠骨折部位WWP1的表达,在体内验证WWP1为miR-142-5p的靶基因。结果： 1、成功在野生型、miR-142-5p骨组织特异性高表达型及抑制型转基因小鼠中构建骨折模型。 2、X线摄片显示,在miR-142-5p骨组织特异性高表达小鼠,骨折愈合速度较WT型明显加快,而在miR-142-5p骨组织特异性抑制小鼠,骨折愈合速度较WT则明显下降。 3、组织HE染色显示,在miR-142-5p骨组织特异性高表达小鼠,骨痂的钙化、编织骨的形成及塑形完成较WT明显增快,而在miR-142-5p骨组织特异性抑制小鼠,骨痂的钙化、编织骨的形成较WT则明显下降。 4、在WT小鼠,miR-142-5p及骨钙素水平在骨折后21天达到高峰；而在miR-142-5p骨组织特异性高表达小鼠,miR-142-5p及骨钙素水平表达增加且在骨折后14天即达到高峰；在miR-142-5p骨组织特异性抑制小鼠,miR-142-5p及骨钙素水平较野生型显著下降。 5、在小鼠中,骨折部位WWP1mRNA的表达水平随着骨折后时间延长均呈显著上升趋势,并在骨折后21天达到高峰,在miR-142-5p抑制型转基因小鼠上升较WT小鼠更显著。结论： miR-142-5p骨组织特异性高表达可以促进骨折愈合,而miR-142-5p骨组织特异性抑制则延缓骨折愈合,miR-142-5p在动物模型骨折愈合过程中仍然通过靶基因WWP1发挥作用。第三部分MiR-142-5p对衰老小鼠骨折愈合的治疗作用目的：建立衰老小鼠骨折模型,观察agomir-142-5p对衰老小鼠骨折愈合的治疗作用。方法： (1)、在18月龄的C57BL/6小鼠中行单侧股骨骨干横形骨切开术并锁钉内固定,构建衰老小鼠骨折模型；(2)、使用qRT-PCR法检测衰老小鼠骨折后Od、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨钙素表达,观察其表达模式；(3)、在骨折部位注射miR-142-5p拟似物agomir-142-5p,观察衰老小鼠骨折后28d的X线表现；(4)、用组织HE染色法,观察agomir-142-5p干预后衰老小鼠骨折后28d的骨折愈合情况。结果： 1、成功构建衰老小鼠骨折模型,并发现与年轻小鼠相比,衰老小鼠骨折后各个时期骨折部位miR-142-5p的表达均显著降低。此外,衰老小鼠骨折后miR-142-5p的表达高峰延迟到骨折后28d。 2、在衰老小鼠,骨折后各个时期骨折部位骨钙素的表达水平较年轻小鼠均显著降低。 3、骨折后28天,注射PBS或Agomir对照的衰老小鼠X线摄片仍可见模糊骨折线,骨痂量少,而在Agomir-142-5p注射的衰老小鼠,可见骨折线消失,骨痂较大,密度高。 4、在agomir-142-5p注射小鼠,28天时可见骨痂钙化,部分连接成片,编织骨形成。而在agomir control及PBS注射小鼠,骨折后28天仅可见较多纤维性骨痂及软骨性骨痂,部分钙化。结论： Agomir-142-5p骨折部位局部注射能够促进骨折愈合,改善衰老小鼠骨折愈合延迟。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R683;R-332
【部分图文】：

软骨性骨,转基因小鼠,编织骨,博士学位论文

WT,miR-142-ob-TG和mR142-ob-S转基因小鼠骨折后7d.14d.lid的骨折部位组织切片的HE染色

转基因小鼠,骨钙素,表达水平

图2-5 qRT-PCR法测定WT和miR-142-ob-S转基因小鼠骨折后Od、7d、14d、2Id的骨折部位骨妈素表达水平。（*p<0.05)4、MiR-142-5p抑制转基因小鼠骨折后不同时期的WWP1的表达我们在前期研究中已经在体外细胞实验中证实WWP1为miR-142-5p在成骨细胞内的祀基因。在WT与miR-142-ob-S转基因小鼠骨折模型中，我们在骨折后的7d、14天、21天分别行骨折部位qRT-PCR和Western检测，发现在miR-142-ob-S转基因小鼠中，WWP1 mRNA的表达水平随着骨折后时间延长均34

衰老小鼠,小鼠,表达水平

士学位论文第结果、衰老小鼠骨折后不同时期骨痂部位iniR-142-5p表达我们在18月龄的C57BL/L小鼠中行单侧股骨骨干横形骨切^u术并锁，构建衰老小鼠骨折模型。在骨折后的Od、7d、14d、21d和28天，取组织通过qRT-PCR法行miR-:i42-5p表达检测。我们发现与年轻小鼠相小鼠骨折后各个时期骨折部位miR-142-5p的表达均显著降低。此外，在骨折后21天，骨折部位rniR-142-5p表达水平达到高峰，而衰老小鼠骨折后28(1。（图3-2)

【参考文献】