阴道毛滴虫RRas基因克隆，表达及鉴定

发布时间：2020-09-15 19:30

　　阴道毛滴虫是一种性传播原生动物寄生虫,致病机制尚不清楚。RRas蛋白已证实在细胞的生长、分化、细胞增殖,细胞骨架、细胞粘着和迁移中发挥重要作用。阴道毛滴虫RRas蛋白与人类有相似的结构域和功能域,是否对阴道毛滴虫致病性有关,需要进一步研究。本研究采用基因工程技术一步克隆并表达了阴道毛滴虫RRas基因。将重组蛋白纯化后,免疫BALB/c小鼠,测其效价,获得重组蛋白免疫血清,应用SDSPAGE和Western blot技术分析该重组蛋白的免疫原性,并为其在阴道毛滴虫组织内定位做准备。利用CCK8试剂盒检测阴道毛滴虫RRas蛋白对人类肿瘤细胞增殖的作用,为探讨阴道毛滴虫RRas蛋白对人类肿瘤的发生发展作用做准备。材料与方法1.阴道毛滴虫虫株、质粒,菌株,实验动物及细胞系阴道毛滴虫(阴道毛滴虫分离株来自郑州大学第三附属医院检验科门诊女性患者)。BALB/c小鼠(雌性、四周龄,河南省实验动物中心)PQE-80L质粒,BL21菌株(由本实验室保存),所用细胞系为人宫颈癌(HeLa)细胞系(由本实验室保存)食管癌(Eca-109)细胞系(病理教研室保存)。2.阴道毛滴虫RRas基因的一步克隆与表达登陆GenBank查阴道毛滴虫RRas基因的mRNA序列,结合PQE-80L质粒的克隆位点及同源重组序列设计上下游引物。,提取阴道毛滴虫的总RNA,反转录为cDNA,通过PCR反应获得目的基因经PCR产物纯化试剂盒纯化后,将其克隆至线性化后的表达载体PQE-80L,对重组质粒进行测序鉴定,鉴定正确后,将PQE-80L-Tv RRas转入大肠杆菌BL21(DE3)。对重组质粒进行菌落PCR,双酶切及测序鉴定,鉴定后,用合适浓度IPTG诱导阳性BL21,收集菌体沉淀,经一步法细菌活性蛋白提取试剂盒提取蛋白,进行SDS-PAGE,观察否有目的蛋白表达,并对表达产物的可溶性进行分析。3.阴道毛滴虫重组蛋白PQE-80L-TvRRas纯化及鉴定用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用生工生物活性蛋白提取试剂盒提取蛋白,可溶性鉴定后,目的蛋白用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒亲和层析纯化。进行Western blot分析,鉴定阴道毛滴虫重组AP51蛋白的免疫原性及抗原性。4.阴道毛滴虫重组蛋白对人类肿瘤细胞增殖的作用重组蛋白PQE-80L-TvRRas和人hela细胞及Eca-109细胞共培养一个细胞周期后,用CCK8试剂盒检测其对肿瘤细胞增殖的作用。结果1.通过双酶切及测序鉴定,结果显示PQE-80L-TvRRas重组质粒构建成功.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(0.5mmol/mlIPTG)诱导表达,SDS-PAGE结果显示在26 kDa处新增加一条带,表明重组蛋白表达成功。所克隆的阴道毛滴虫RRas基因对长度为664bp,编码蛋白含有204个氨基酸,等电点为4.81,蛋白大小约为23.6kd,对该蛋白进行可溶性鉴定发现其以可溶性形式表达。2.Western blot结果表明,抗His标签鼠单克隆抗体能够识别PQE-80L-Tv RRas蛋白,阴道毛滴虫重组蛋白可被阴道毛滴虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠血清识别,而不能被正常BALB/c小鼠血清识别。阴道毛滴虫可溶性蛋白可被阴道毛滴虫重组蛋白免疫BALB/c小鼠血清识别,而不能被正常BALB/c小鼠血清识别。均在约24KD处显示明显条带,表明该蛋白有较好的抗原性及免疫原性。3.CCK8细胞增殖结果证明,阴道毛滴虫重组蛋白对人类肿瘤细胞hela细胞及Eca-109具有促进细胞增殖的作用。结论1.一步克隆并成功表达了阴道毛滴虫RRas基因。2.重组蛋白具有良好的抗原性以及免疫原性。3.阴道毛滴虫RRas重组蛋白与人类肿瘤细胞hela细胞及Eca-109共孵育,与人类RRas蛋白有相同的促进细胞增殖的作用。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R382.2

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