肝郁脾虚证模型大鼠血管活性肠肽及其受体变化及逍遥散的调节作用

发布时间：2020-09-16 09:15

　　研究背景肝郁脾虚证是一种中医常见证候,主要涉及肝和脾两个脏腑,肝郁和脾虚互为因果。若情志不遂,肝主疏泄功能失常,出现肝木横乘脾土;若饮食不节、劳倦伤脾,脾失健运则出现脾土反侮于肝木。由于肝脾两脏在病理上相互影响传变,在“肝失疏泄木乘脾土”和“脾失健运反侮于肝”这两种不同病因导致相同证候的理论研究思路引导下,现代医学中与情绪和饮食密切相关的脑-肠轴逐渐成为了肝郁脾虚证研究的一个热点方向。脑肠肽是一类在中枢神经系统和胃肠道表达的内分泌信号分子,通过脑-肠轴参与摄食调节及能量平衡。血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)是一种广泛分布于中枢与外周的脑肠肽,既可作为神经递质发挥作用,也可通过与其受体结合调节生理功能。VIP在调节胃肠道、应激、调节学习记忆等方面均可发挥作用。在前期研究中已通过慢性不可预知温和应激方法成功复制肝郁脾虚证大鼠模型,并且发现在肝郁脾虚证模型大鼠中存在着脑肠肽异常表达的现象,可能是肝郁脾虚证脑肠互动异常的机制之一。但VIP及其受体的表达是否与肝郁脾虚证脑肠互动异常有关,是否是肝郁脾虚证模型大鼠出现相关胃肠道症状的原因尚不明确。逍遥散是《太平惠民和剂局方·卷九治妇人诸疾》中记载的一首治疗肝郁脾虚证的经典方剂。前期研究表明在慢性应激方法制备的肝郁脾虚证大鼠模型中,逍遥散具有良好的调节作用,其作用机制可能与调节异常表达的脑肠肽有关。但VIP及其受体是否是逍遥散治疗肝郁脾虚证的一个作用靶点还有待研究。研究目的观察中枢(海马)和外周(结肠)的VIP及其受体在肝郁脾虚证中的表达,探讨肝郁脾虚证的实质以及脑肠互动异常的机制,并分析逍遥散的调节作用、探讨逍遥散治疗肝郁脾虚证的作用靶点。研究方法采用六周慢性不可预知温和应激方法复制肝郁脾虚证大鼠模型,造模手段包括束缚、热烘、冰水游泳、陌生物体刺激、白噪音、笼具倾斜、禁食禁水,随机分配造模手段。造模结束后通过一般状态、体重、摄食量、行为学检测(旷场实验、糖水消耗实验、强迫游泳实验),并通过逍遥散、归脾丸以方测证,用氟西汀作为阳性对照药,从多角度对所建立的模型进行全面评价。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测海马和结肠 VIP 以及受体VPAC2的表达情况,并观察逍遥散的调节作用。采用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测大鼠结肠部位VIP的含量变化及逍遥散的调节作用。研究结果(1)经过六周慢性不可预知温和应激造模之后,模型大鼠出现毛发枯黄、倦怠少动、大便干湿不调等一般状态变化以及摄食量的降低和体重增加的减缓的现象。行为学结果显示旷场实验中模型大鼠总穿格数和修饰次数减少,强迫游泳不动时间增长,而逍遥散组、氟西汀组大鼠可见相关指标改善,归脾丸组大鼠部分指标有所改善。(2)RT-qPCR实验结果表明模型大鼠海马VIP及VPAC2 mRNA表达显著升高,结肠VIP mRNA表达明显降低,而VPAC2 mRNA表达显著增加,而灌服逍遥散后大鼠海马VIPmRNA表达与模型大鼠相比显著降低。(3)ELISA实验结果表明模型大鼠结肠VIP含量降低,逍遥散组大鼠VIP含量相较模型组增高,蛋白表达情况与基因表达情况一致。研究结论(1)采用六周慢性不可预知温和应激方法成功复制出了肝郁脾虚证大鼠模型,行为学检测结果表明模型大鼠存在着类似于中医肝郁脾虚证的情绪抑郁、腹胀食少,大便形态改变等变化,而运用中药复方逍遥散和归脾丸以方测证,以及治疗抑郁症的经典药物盐酸氟西汀干预后各指标的逆转也从侧面印证了模型的成功建立。(2)脑肠肽VIP及其受体在中枢(海马)和外周(结肠)的异常表达可能是肝郁脾虚证脑肠互动异常的原因之一,结肠部位VIP含量降低可能是肝郁脾虚证模型大鼠出现食少、便溏、腹胀等的原因之一。(3)逍遥散能不同程度地改善中枢以及外周血管活性肠肽及其受体的异常表达,改善情志抑郁以及腹胀、食少、便溏等胃肠道症状,提示逍遥散治疗肝郁脾虚证的机制之一可能是通过脑-肠轴调节异常表达的VIP。因此,我们认为脑肠肽VIP的异常表达是肝郁脾虚证的生物学基础之一。脑肠互动异常导致VIP分泌异常,模型大鼠的进食量和体重出现了明显的降低,并且伴随着抑郁样的情绪状态。逍遥散干预后相关指标的逆转说明其可能通过调节中枢及外周VIP及其受体表达从而起到疏肝解郁、调节食欲、减少便溏的作用。以此为切入点揭示了肝郁脾虚证脑肠互动异常的机制以及逍遥散作用的靶点。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5;R-332
【部分图文】：

胃肠运动,神经系统,免疫系统,胃肠道

逑内脏与ＣＮＳ联系起来的重要神经内分泌网络［６］。医学研究一般认为，神经系统对胃肠运逡逑动的调控通过三个层次相互协调作用来实现（图１）：第一层次是ＥＮＳ的局部调控；第逡逑二层次是位于椎前神经节，接受和调控来自ＥＮＳ和ＣＮＳ两方面的信息；第三层次是ＣＮＳ，逡逑由脑的各级中枢和脊髓接受机体内外环境变化时传入的各种信息，经过整合再由植物神逡逑经系统和神经－内分泌系统将其调控信息传送到肠yL经系统或直接作用于胃肠效应细胞逡逑［７］。胃肠道正是在这种复杂而精密的神经调控下完成对于机体内外环境的适应性活动，逡逑从而实现其生理功能。当外源性（味觉、视觉、嗅觉、听觉、）或内感性（情感、心理逡逑因素）信息通过高级中枢传出的神经冲动，可以影响胃肠感觉、运动，导致胃肠道出现逡逑运动异常（对各种应激的运动反应增强等）和对各种应激的敏感性增强，进而出现胃肠逡逑功能的紊乱；反之，胃肠道的不适或异常也可反过来作用于中枢的痛感、情绪和行为。逡逑这种在不同层次将胃肠道与中枢yL经系统联系起来的神经内分泌网络称为脑－肠轴逡逑（Ｂｒａｉｎ－ｇｕｔ邋ａｘｉｓ）。在胃肠道疾病研究中也称之为肠－脑轴（Ｇｕｔ－ｂｒａｉｎ邋ａｘｉｓ）。机体通过脑－逡逑肠轴之间的神经内分泌网络这一双向环路进行胃肠功能的调节作用称之为脑肠互动逡逑（Ｂｒａｉｎ－ｇｕｔ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）邋0逡逑ｌａｓｌｅ逦，一而？、．．．．．．邋邋逡逑Ｓｍｄｌ邋ｒＷ邋Ｅｍｏｔｉｏｎ邋）＜Ｃ：＾＞ｊ邋Ｂｅｈａｖｉｏｒ邋！逡逑Ｓｉｇｈｔ逦＇邋ｖ％．邋Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．＾邋ｉ逦ｉ逡逑；Ｓｏｕｎｄ逦厂逡逑Ｉ邋Ｐｈｖｂｉｏｌｏａｙ逡逑

血管活性肠肽,蛋白水解,位置

化最后生成ＶＩＰ以及ＰＨＭ［Ｕ］（图１）。其中前体蛋白水解得到的ＶＩＰ产物如下：前原逡逑ＶＩＰ（２２－７９），肽组氨酸异亮氨酸、甲硫氨酸（ＰＨＩ／ＰＨＭ）（８１－１０７），前原邋ＶＩＰ（邋１１１－１２２）、逡逑ＶＩＰ邋（１２５－１５２），和前原ＶＩＰ邋（１５６－１７０）（图２）。溶液构象的结果指出，ＶＩＰ具有２０％逡逑的螺旋结构，其余８０％是松散无序结构。从结构角度分析，ＶＩＰ的１０？２８位顺序对其逡逑作用的专一性较为关键［１４］。８0（１0１＾２１＾等人合成了一系列ＶＩＰ类似物，其中ＶＩＰ（７？２８）逡逑具有１５％的生物活性。Ｍａｋｈｌａｕｆ等人研究表明ＶＩＰ的１？８，邋１８？２８，１５？２８和１４？２８逡逑片段均无活性［１５］。在陆地动物进化过程中，ＶＩＰ的初级氨基酸结构保存的很完好，在所逡逑有哺乳动物中，除了在豚鼠中有４个氨基酸替换（８６％个同源性）之外，其余所有哺乳逡逑动物的ＶＩＰ初级氨基酸结构都是相同的；逡逑ＶＩＰ主要由中枢神经和外周神经系统产生，由副交感神经节后纤维所释放，并与乙逡逑酰胆碱共存。在胃肠道中，ＶＩＰ释放是由类似于调节肠道放松的机制调节的。迷走神经逡逑和盆腔神经的电刺激、前列腺素Ｅ１、催产素、皮质酮的刺激都能促进ＶＩＰ的释放

受体,中枢,分布情况,纹状体

１．２．１中枢分布逡逑在中枢，ＶＩＰ主要分布于大脑皮层、下丘脑、杏仁核、海马、视交叉上核、纹状体逡逑和延髓的迷走神经中枢（图３）。此外在脑的大动脉，特别是Ｗｉｌｌｉｓ环、脉络丛区域也有逡逑大量分布。在下丘脑某些区域、皮质、杏仁、海马、纹状体等处的水平较高。垂体门脉逡逑血中ＶＩＰ的浓度显著高于外周血［＇邋此外，ＶＩＰ邋Ｉｋ分布于支配脑血管的yL经纤维中＿。逡逑１．２．２外周分布逡逑除了中枢以外，血管活性肠肽在外周也有广泛分布。研究表明血管活性肠肽能神经逡逑２６逡逑

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