基于结核病多病程小鼠模型的PD-L1作用机制研究及利用遗传多样性小鼠对结核易感性的研究

发布时间：2020-09-16 17:00

　　 目的创建新的小鼠急性感染-潜伏-复发感染模型,为结核病多病程的机制研究、诊断以及抗结核药药效学评价研究提供基础。方法结核菌标准株H37Rv菌液106CFU经尾静脉感染C57BL/6雌性小鼠,两周之后给予异烟肼(1Omg/kg)连续治疗四周,治疗停药后开始注射TNF-α抗体(50ug/只),每周一次,连续四周。分别在感染两周、异烟肼治疗四周以及TNF-α抗体诱导四周后解剖小鼠,通过对各时间点的肺、脾和肝组织荷菌量及病理病变的定量分析,来最终评价新的多病程结核动物模型建立是否成功。结果小鼠感染H37Rv后,感染第2周,肺脏、脾脏、肝脏组织的荷菌量(LgCFU/mL)分别是2.46±0.38,4.66±0.24,4.31 ±0.07,感染后荷菌量明显升高。感染2周时,总体观察无明显病变,组织病理检查显示:肺脏内可见数个肉芽肿,肉芽肿主要由巨噬细胞及较多淋巴细胞构成,血管周围淋巴细胞浸润较明显;肝组织可见大量散在(每视野约20个)的面积为2-10mm2的肉芽肿,肉芽肿主要由巨噬细胞、淋巴细胞及少数中性粒细胞构成;脾脏白髓区及红髓区被肉芽肿破坏,肉芽肿主要由巨噬细胞组成。异烟肼治疗4周之后,治疗组的肺、脾和肝荷菌量(LgCFU/mL)分别为:0,2.68±0.59,2.58±0.51,而此时感染对照组肺脏、脾脏、肝脏荷菌量分别为3.64±0.54,4.06±0.38,3.06±0.28。治疗组无肉眼可见病理改变,组织病理结果显示(10O×视野):肺组织除偶可见的血管旁炎性细胞浸润以外,肺泡结构清晰,肺泡壁略增厚;肝组织中偶可见肉芽肿,面积约为0.5-5mm2,伴有轻微的干细胞水肿;脾组织偶见散在的不规则的细小肉芽肿。治疗结束后停药,四周后自然复发或者用TNF-α抗体诱导复发,TNF-α抗体诱导组肺、脾、肝脏组织荷菌量(LgCFU/mL)为别为4.42±0.07,4.72±0.02,3.68±0.04。治疗后自然复发组肺脏、脾脏、肝脏荷菌量分别是3.74±0.14,4.34±0.24,3.47±0.20;肺、脾脏病变百分比(%)分别为 4.11 ± 1.52,6.16±1.67,肝脏内肉芽肿密度(number/mm2)为 1.25±0.42。TNF-α抗体诱导组相对于治疗后自然复发组,各组织肉芽肿样病变明显加重。结论小鼠感染结核菌2周后,肺脏、脾脏和肝脏荷菌量及组织肉芽肿病变提示结核感染处于急性期。异烟肼治疗4周之后,肺、脾、肝荷菌量较低且病变轻微,转入潜伏期。TNF-α抗体诱导后荷菌量和病理病变明显加重,提示潜伏感染后复发,并且同组内小鼠复发起点和复发水平较一致。因此,新的急性感染-潜伏-复发感染的多病程小鼠结核模型建立成功,整个模型的周期为10周,大大缩短了研究的时间,并且潜伏期、复发期荷菌量和病变参数稳定,适合于结核机制研究和药物疫苗的评价研究。目的利用功能性PD-L1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)单抗阻断巨噬细胞介导的PD1/PD-L1通路,研究其对于小鼠结核治疗后复发的免疫干预作用和机制。方法106CFU H37Rv经尾静脉感染C57BL/6雌性小鼠获得结核的急性感染,两周之后分别给予异烟肼(10mg/kg)和异烟肼联合PD-L1单抗(50ug/只)连续治疗四周,获得潜伏感染,在潜伏期用TNF-α抗体(50μg/只)诱导四周使其复发。通过对各时间点的肺、脾和肝组织病理及荷菌量的定量分析,探讨PD-L1单抗对小鼠活动性结核及结核复发的干预作用。利用体外实验,进一步阐明敲低PD-L1对结核菌感染的巨噬细胞凋亡的影响。结果小鼠感染后,前两周肺、脾和肝荷菌量较高(3-4LgCFU/mL)、肉芽肿病变较重,表现为活动性结核,异烟肼和异烟肼联合PD-L1单抗分别治疗四周之后,肺、脾和肝荷菌量均较模型对照组显著性地降低,肉芽肿样病变也显著减轻,但是两个治疗组之间没有显著性的差异。而在复发期,相比较于异烟肼治疗组,异烟肼联合PD-L1单抗治疗组能够显著降低复发期组织荷菌量,减轻病理病变。体外实验证实:用PD-L1抗体或siRNA敲低巨噬细胞上PD-L1,结果发现二者都能能促进结核感染的巨噬细胞凋亡。结论功能性的PD-L1抗体可以抑制结核复发,敲低巨噬细胞上PD-L1或阻断PD1/PD-L1通路能促进巨噬细胞凋亡,提示阻断PD-L1能够有效的协助异烟肼治疗结核病,并且显著地抑制结核的复发。目的在多个遗传多样性小鼠品系中研宄结核对小鼠的易感性,进一步在The Geneminer数据库中对遗传多样性小鼠的荷菌量以及病理病变定量分析,预测易感基因位点以及相应的SNPs。方法以1×l0~6CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉途径感染四周龄雌性C57BL/6小鼠以及17个同性别同周龄遗传多样性小鼠品系,感染四周之后脱颈椎处死,取肺、脾、肝组织。通过量化评价病理病变和组织荷菌量来确定遗传多样性小鼠的易感性表型;利用The Geneminer数据库对遗传多样性小鼠的荷菌量以及病理病变定量分析,预测易感基因位点以及相应的SNPs。结果18个小鼠品系的荷菌量和病变呈现不同的值,其中荷菌量高的小鼠品系病变值可以较高也可以较低,病变值高的也与荷菌量不一定一致,具体结果为:肺、脾和肝脏的荷菌量值由低到高排序分别为:FEW♀,LAMA♂ DET3♂,LUS♂ BOM♀,LAT♂,PUB♀,NUK♀,SHE♂,TOP♀,ROGAN♂,PIPING♂,DAVIS♀,C57♀,BOON♀,LOT♀,SAT♂,BEM♂;DET3♂,SHE♂,BOM♀,C57♀,PUB♀,ROGAN♂,TOP♀,LUSA♂,FEW♀,NUIC♀,LAM♂,DAVIS♀,LAT♂,PIPING♂,SAT♂,BEM♂,LOT♀,BOON♀;LUS♂,SHE♂,PUB♀,TOP♀,BOM♀,DET3♂,FEW♀,DAVIS♀,C57♀,LAM♂,ROGAN♂,NUK♀,PIPING♂,BEM♂,SAT♂,BOON♀,LAT♂,LOT♀。用“MugaQTL(narmalise)”分析不同组织的荷菌量,发现:肺脏、脾脏和肝脏的目标基因分别位于第3号,4号和3号染色体,其中脏中预测到143个目标编码的SNPs位点,脾脏中预测264个目标编码的SNPs位点,肝脏没有预测到目标编码的SNPs位点。结论结核菌对不同小鼠品系的易感性不同,其中同一品系病变和荷菌量不一定保持易感性一致的关系,并且不同组织脏器的易感性也有差异,因此按照不同组织的荷菌量或者不同组织的病变进行易感基因的分析。根据荷菌量值,利用Geneminer数据库预测肺和肝的易感基因在3号染色体上,脾的易感基因在4号染色体上。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R52;R-332
【部分图文】：

肺脏、脾脏、肝脏荷菌量（ＬｇＣＦＵ／ｍＬ）分别为：３．６４±０．５４，邋４．０６±０．３８，３．０６土逡逑０．２８，相对于感染对照组，异烟胼治疗４周的肺脏、脾脏、肝脏组织荷菌量显著性降低逡逑（Ｐ＜０．００１，邋Ｐ＜０．０１，邋Ｐ＜０．０５）0逡逑异烟肼治疗４周之后，不加ＴＮＦ－ａ抗体诱导组的肺脏、脾脏、肝脏的荷菌量分别逡逑为：３．７４±０．丨４，４．３４±０．２４，邋３．４７±０．２０。ＴＮＦ－ａ抗体诱导４周后，肺脏、脾脏、肝脏逡逑的荷菌量分别为：４．４２±０．０７，４．７２±０．０２，３．６８土０．０４。相对于感染对照组，不加ＴＮＦ－逡逑ａ抗体诱导组（图丨－３－ＢＩＮＨ）和ＴＮＦ－ａ诱导组（图丨－３－ＢＴＮＦ－ａ邋）脾脏的荷菌量增加，逡逑但只有ＴＮＦ－ａ诱导组的差异存在显著性（Ｐ＜０．０５），而脾脏和肝脏的荷菌量还未达到感逡逑染对照组的水平。相较于不加ＴＮＦ－ａ抗体诱导组，ＴＮＦ－ａ诱导组的肺脏和脾脏荷菌量逡逑显著性上升（Ｐ＜0．00ｌ，Ｐ＜0．0５），肝脏虽然也上升，但是差异不具显著性。逡逑整个模型实验过程中的荷菌量的动态变化如图所示（见图１－３－Ｃ），感染对照组：肺逡逑脏在０－１０周荷菌量逐渐上升；脾脏在０－２周内荷菌量上升，２－１０周荷菌量持续下降；肝逡逑脏荷菌量０－２周内上升，２－６周下降，６－１０周又上升。异烟胼治疗组感染后０－２周内荷逡逑菌量与感染对照组趋势一致，在２－６周，肺脏、脾脏和肝脏荷菌量下降，６－１０周，其中逡逑ＴＮＦ－ａ诱导组和无ＴＮＦ－ａ抗体诱导组的荷菌量都ｔ升，但是前者荷菌量增幅大于后者。逡逑１０0ｎＬ，１０７ＣＦＵ邋的异烟胼（１０ｍｇ／ｋｇ）治ＴＮＦ－ａ邋（５０｜ｉＬ／只）治逡逑

第二部分逡逑为１００Ｘ倍。脾、肝和肺组织中标记处为病变逡逑图２－３小鼠结核模型中肺脾肝不同时期的组织病理改变（ｎ邋＝邋４）逡逑Ｎｏｔｅ．邋Ｆｉｇｕｒｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｌｅｆｔ邋ｔｏ邋ｒｉｇｈｔ邋ｓｔａｎｄ邋ｆｏｒ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｐｌｅｅｎ，邋ｌｉｖｅｒ邋ａｎｄ邋ｌｕｎｇ逡逑ｔｉｓｓｕｅｓ，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ：邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｘ邋１２．５邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｌａｒｇｅｒ邋ｐｉｃｔｕｒｅ，邋ｘ邋１２．５邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑ｕｐｐｅｒ邋ｌｅｆｔ邋ｉｎｓｅｔｓ．邋Ｔｈｅ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｓｐｌｅｅｎ，邋ｌｉｖｅｒ邋ａｎｄ邋ｌｕｎｇ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｐｉｃｔｕｒｅｓ邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｄｉｓｅａｓｅ邋ｌｅｓｉｏｎｓ．逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｌｕｎｇ，邋ｓｐｌｅｅｎ邋ａｎｄ邋ｌｉｖｅｒ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋Ｍ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｍｉｃｅ逡逑３结核菌感染巨噬细胞后ＰＤ－Ｌ１的表达逡逑结核菌感染巨噬细胞２４小时后，流式细胞仪检测，左图（图２－４－Ａ）为巨噬细胞阴逡逑性对照，右图（图２－４－Ｂ）为Ｈ３７Ｒｖ感染巨噬细胞２４小时的结果，红色峰表示感染细逡逑胞ＰＤ－Ｌ１的表达，蓝色峰表示未感染细胞ＰＤ－Ｌ１的表达。Ｈ３７Ｒｖ感染巨噬细胞２４ｈ后，逡逑红色峰右移

图３－８），其中肺脏组织荷菌量在３号染色体?

【参考文献】

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本文编号：2820113